“一測多評”法同步測定大黃中五種蒽醌類成分的含量

廣西桂林食品藥品檢驗所（541002）覃曉 周文杰 李夏林

附圖 混合對照品(左)及樣品圖譜(右)

大黃為蓼科植物掌葉大黃R h e u m p a l m a t u m L.、唐古特大黃R h e u m tanguticum Maxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和根莖[1]。是臨床上用量較大的一味藥，其主要活性成分為大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等。2010版藥典在用高效液相色譜法對這5種成分的含量進行測定時，需要用到5種對照品，而中藥對照品通常都較貴，且難以純化。因此，本實驗根據“一測多評”的思路[2]，擬用大黃素對照品為內標物，通過測定它與蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的校正因子，對大黃藥材中5種成分的含量進行測定，為大黃藥材的質量控制建立一種新的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：島津LC-20AT高效液相色譜儀（色譜儀1）；島津2010AHT高效液相色譜儀（色譜儀2）；Waters高效液相色譜儀（色譜儀3）；色譜柱：島津C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；漢邦C18柱(4.6mm×250mm，5μm）；特納C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；ABS265-S十萬分之一天平。

1.2 試藥 對照品：大黃素，批號：1 1 0 7 5 6-2 0 0 1 1 0 ，大黃酸，批號：110757-200206，大黃酚，批號：110796-200716，蘆薈大黃素，批號：110795-200605，大黃素甲醚，批號：110758-200408，均購自中國食品藥品檢定研究院。大黃藥材為藥店采購。甲醇、磷酸為色譜純，三氯甲烷、鹽酸為分析純，水為純化水。

2 原理

在一定的線性范圍內，紫外檢測器的響應值（A）與組分的濃度（C）成正比，即：K=A/C[2][3][4]，在對多組分的物質進行含量測定時，可以先選定一個合適的組分作為內標物，建立該組分與其它組分的校正因子（?），如公式（1）所示：

在一定的色譜條件下，配置一定濃度的內標物和對照品的溶液，以進樣量為橫坐標，以峰面積A為縱坐標，分別測定內標物和對照品的標準曲線，將標準曲線的截距校正為0后，用兩條標準曲線斜率K的比值即可求得校正因子（?） 。

以上公式即為用內標物與校正因子測定其它組分含量的計算公式。式中，SA為內標物質的峰面積或峰高；RA為對照品的峰面積或峰高；XA為供試品的峰面積或峰高；Sc為內標物質的濃度；Rc為對照品的濃度；Xc為供試品的濃度。

3 方法與結果

3.1 色譜條件[1]色譜柱： C 1 8 柱（4.6mm×250mm，5 μ m）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；檢測波長：254nm；流速：0.8 ml·min-1；柱溫：35℃；進樣量10μl；理論板數按大黃素峰計不低于3000，各峰的分離度均應大于1.5。見附圖。

3.2 對照品溶液的配制 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚對照品各16mg，置200ml量瓶中（A瓶），精密稱取大黃素甲醚對照品10mg置250ml量瓶中（B瓶），分別加甲醇至刻度；精密量取A瓶與B瓶中溶液各2ml置10ml量瓶中（C瓶），加甲醇至刻度，即得（每1ml中含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各16μg，含大黃素甲醚8μg）。

3.3 供試品溶液的制備 取大黃粉末（過四號篩）0.15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10ml，超聲處理2分鐘，再加三氯甲烷10ml加熱回流1小時，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3.4 線性范圍：精密量取混合對照品溶液1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl，按“3.1”項下的色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品的進樣量為橫坐標，得各成分的標準曲線為：蘆薈大黃素：Y=5857835X-16964，R=1.0000；大黃酸：Y=5402446X-22526，R=1.0000；大黃素：Y=5134066X-13903，R=1.0000；大黃酚：Y=5855968X+8868，R=0.9999；大黃素甲醚：Y=3794269X-8019，R=1.0000。各成分的線性關系良好。

3.5 校正因子（?）的測定：精密量取混合對照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl注入液相色譜儀，測定它們的峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品的進樣量為橫坐標繪制標準曲線，將標準曲線的截距校正為0后，內標物與對照品的斜率之比即為它們的校正因子（?），見附表1。

3.6f值的耐用性考察：在用高效液相色譜法進行操作的時候，色譜條件通常會發生一些變化，因此，我們對幾種常見的變化因素，包括色譜柱、色譜儀、波長偏差以及流速變化進行了考察，結果顯示， 值的差異不大。見附表2。

3.7 各組分色譜峰的定位 在只使用一個對照品的情況下，如何對其他3個組分的色譜峰進行定位是一個關鍵問題，參照王智明[2]的思路，采用相對保留時間差對它們進行定性時，發現不同儀器對各組分的出峰時間影響較小，而不同填料色譜柱則對各組分的出峰時間影響較大，見附表3。由于同樣的成分，在不同色譜柱及色譜儀器中光譜是相同或相似的，因此，為了對各組分色譜峰的定位更準確，可以采用相對保留時間差與光譜圖相結合的方法確定色譜峰的歸屬。

3.8 一測多評法與外標法檢測樣品含量結果比較 取同一批大黃藥材，分別采用對照品外標法和一測多評法測定6次，結果見附表4。每組數據經 檢驗，P值均＞0.05，兩種方法結果無顯著差異。

4 討論

4.1 本文根據“一測多評”的思路，以大黃素為內標物，測定大黃素與其它組分的校正因子，用內標物加校正因子對其它組分的含量進行測定，結果顯示，該法與對照品外標法測定結果沒有顯著差異，各校正因子在耐用性考察中重現性較好，說明“一測多評”應用到大黃的含量測定中是可行的。4.2 在使用“一測多評”進行樣品含量測定的過程中，增加了校正因子這個量值，它的測量誤差將直接傳遞給最終的測定結果，導致誤差增大。為了合理表征測定結果的分散性，筆者認為今后可以對校正因子的不確定度進行評定。

4.3 同對照品外標法相比，使用“一測多評”具有以下優勢：不僅可以減少對照品的使用量，還能簡化樣品的檢驗程序，對于一些價格昂貴，不易得到的對照品來說，非常適用，因此，在將來的藥品檢測方法的應用中，“一測多評”技術將具有很大的發展前景。