丹皮酚對二乙基亞硝胺誘發大鼠肝癌前病變的預防作用*

宋藝君　楊史軍　王　湘　張東星　馮麗莉　孫　燕　蔡大勇　王玥琦△

陜西中醫藥大學藥學院(咸陽712046)

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丹皮酚對二乙基亞硝胺誘發大鼠肝癌前病變的預防作用*

宋藝君▲楊史軍□王湘▲張東星▲馮麗莉▲孫燕▲蔡大勇□王玥琦△▲

陜西中醫藥大學藥學院(咸陽712046)

目的：研究丹皮酚(Pae)對二乙基亞硝胺(DEN)誘發大鼠肝癌前病變的預防作用，并探討其作用機制。方法：采用腹腔注射DEN誘發大鼠肝癌前病變模型。雄性wistar大鼠按照體質量隨機分成3組：對照組、模型組、丹皮酚組。造模給藥16周后處死大鼠，觀察各組大鼠一般狀況，進行肝臟病理組織學檢查，檢測肝功能指標ALT、AST、GST、TBIL，脂質過氧化指標LPO、SOD、INOS、GSH-PX。結果：病理組織學顯示，丹皮酚可以顯著降低肝細胞異型增生灶和異型增生結節數目；降低血清中異常升高的ALT、AST、TBIL、GST、INOS、LPO水平，升高血清中降低的SOD、GSH-PX水平。結論：丹皮酚對于大鼠肝癌前病變具有一定程度的預防保護作用，其保護機制可能與改善肝功能，提高抗氧化能力，抑制脂質過氧化反應有關。

肝癌前病變是指在慢性肝病中出現的肝細胞不典型增生、腺瘤樣增生、肝細胞再生結節、肝細胞小管狀化生和卵原細胞增生，其發展為肝癌的幾率高，尤其是肝硬化病灶中出現的異型增生病灶或結節和異型增生細胞[1]。對于肝癌前病變，西醫學主要采用肝移植、手術治療、化學治療、放射治療、消融術等,但是患者復發率高，預后差，且給患者造成一定的痛苦[2]。采用預防干預的辦法來延緩或阻斷肝癌前病變的發生，使之無法進展成肝癌，可達到防病治病的目的。牡丹皮為毛茛科植物牡丹的根皮和蘿藦科植物徐長卿的全草，主產于陜西、山東、湖南、湖北等地。味苦、辛，性微寒，歸心、肝、腎經，具有清熱涼血，活血化瘀的作用，用于熱入營血、溫毒發斑、夜熱早涼、經閉痛經、跌撲傷痛、臃腫瘡毒等癥[3]。牡丹皮主要含有丹皮酚(Paeonol,Pae)等活性成分,具有抗腫瘤、抗菌、增強免疫力、降壓、促進微循環等藥理作用[4-5]。本試驗以二乙基亞硝胺(DEN)腹腔注射誘發肝癌前病變大鼠模型，研究丹皮酚對肝癌前病變的預防作用，觀察丹皮酚對大鼠肝癌前病變組織病理學的改善和肝功能指標、過氧化指標的影響，為丹皮酚的進一步臨床合理應用提供實驗依據。

1　材料

1.1實驗動物SPF級Wistar大鼠26只，雄性，體重(220±10)g，購于北京維通利華實驗動物公司，許可證號SCXK(京)2010-0013，飼養于北京中醫藥大學實驗動物中心(SPF級)。實驗過程嚴格遵守動物實驗室有關規定。

1.2材料和儀器丹皮酚原料藥(廣西億康藥業股份有限公司,批號101021)；二-乙基亞硝胺(DEN,美國Sigma公司,批號1000928405，密度0.95 g· mL-1)；丙氨酸轉氨酶(ALT)試劑盒、天冬氨酸轉氨酶(AST) 試劑盒、總膽紅素(TBIL) 試劑盒、谷胱甘肽硫轉移酶(GST) 試劑盒、脂質過氧化物酶(LPO)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD) 試劑盒、誘導型一氧化氮合酶(INOS)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX) 試劑盒(南京建成生物工程有限公司)；Multiskan MK3 酶標儀(上海熱電儀器有限公司)；LG16-W型臺式冷凍離心機(北京京立離心機)；vortex-genie2漩渦混合器(北京卓信偉業科技有限公司)；JM-B型萬分之一電子天平(余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司)；44x3顯微鏡(上海光學儀器一廠)；FS/FAS5030石蠟切片機( 德國 LETIZ公司)

2　方　法

2.1大鼠肝癌前病變模型的建立及給藥參照文獻[6]，將26只大鼠按照體重均衡原則隨機分為對照組大鼠6只、模型組和丹皮酚組大鼠各10只。適應性喂養1周后，模型組和給藥組均以 0.5 mL/100 g的DEN腹腔注射,每周50 mg/kg，連續給藥16周；對照組給予等體積生理鹽水。同時給予丹皮酚進行預防：用0.5%CMCNa溶解丹皮酚配制成混懸液，按194.4 mg/kg的劑量給大鼠灌胃給藥，每天1次，連續16周，對照組和模型組給予同體積生理鹽水。

2.2取材各組大鼠均按照安排時間和劑量的DEN(0.5 mL/100 g)腹腔注射,末次注射后84 h,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，分離血清保存于-80℃，統一切取肝臟右葉2x4x6 mm3組織塊，4% 多聚甲醛溶液固定 48 h，石蠟包埋，切片，同步烤片與脫蠟，梯度酒精水化，HE染色。病理評價肝病變的性質和程度。

2.3生化指標采用酶標儀檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行，測量指標為ALT、AST、TBIL、GST、SOD、LPO、GSH-PX、iNOS。

3　結　果

3.1肝臟組織病理表現從HE染色可以看出，對照組：肝小葉和匯管區結構正常。以中央靜脈為中心，肝細胞索呈放射狀排列，核圓，染色質稀疏，核膜清晰。無顯著變性與壞死，無水腫、出血與浸潤。模型組：以肝細胞變性與增生為主要病變。水腫的肝細胞體積增大，部分肝小葉出現肝細胞壞死。肝細胞異型性增生，細胞核體積大，染色深與形態怪異，匯管區可找到淋巴細胞浸潤和膽管增生。丹皮酚組：病變性質與模型組相似，但是有緩解趨勢。增生細胞異型性變小，少見雙核細胞。匯管區有淋巴細胞浸潤和膽管增生。結果見圖1。

3.2生化指標檢測

3.2.1 Pae對大鼠肝癌前病變肝功能的影響：與對照組比較，模型組ALT、AST、TB、GST異常升高，有極顯著性差異(P<0.01),與模型組比較，丹皮酚可減輕血清中異常升高的ALT、AST、TB、GST水平，有極顯著性差異(P<0.01)。試驗結果提示丹皮酚能明顯改善肝功能損傷，且對損傷肝細胞具有一定的修復能力，結果見表1。

表1　Pae對模型大鼠肝功能的保護作用±s)

注：t-test與對照組比較,△P<0.05, ▲P<0.01；與模型組比較, □P<0.05, ■P<0.01

3.2.2Pae對肝癌前病變大鼠脂質過氧化指標的影響：與對照組比較，模型組大鼠GSH-PX、SOD明顯降低，有極顯著性差異(P<0.01),模型組大鼠INOS，LPO明顯升高，有極顯著性差異(P<0.01)；丹皮酚可明顯增加SOD，GSH-PX含量(P<0.01)，且降低血清中LPO，INOS的含量(P<0.01，P<0.05)。SOD和GSH-PX的變化提示丹皮酚可清除氧自由基，顯著提高機體的抗氧化能力；INOS和LPO的變化提示丹皮酚可減少脂質過氧化物對肝細胞和組織的氧化性損傷，從而明顯改善體內的脂質過氧化水平，結果見表2。

表2　Pae對模型大鼠脂質過氧化的保護作用±s)

注：t-test與對照組比較,△P<0.05, ▲P<0.01；與模型組比較, □P<0.05, ■P<0.01

4　討　論

轉氨酶和總膽紅素的血清水平是肝功損傷的重要標志，ALT水平的升高是因為DEN引起的肝細胞損傷使酶外泄到細胞外，通常伴隨著AST水平的升高。在本文研究中，相對于模型組，丹皮酚組可以顯著地減少血清ALT、AST、GST 和 TBIL的水平，暗示了丹皮酚對于DEN引起的肝毒性具有潛力的保護作用。

脂質過氧化是自由基引起細胞損傷的一個主要機制。據相關文獻報道，DEN的攝入可形成脂質過氧化產物如MDA，MDA可以和各種微粒相互作用引起氧化應激壓力，進而促使癌癥的發生。在癌癥形成階段，LPO也會隨著DEN的攝入不斷升高，這一動態作用可能會進一步導致自由基的大量升高，從而破壞了細胞的抗氧化防御能力[7]。在本文研究中，模型組的LPO水平不斷升高，丹皮酚組降低了LPO水平，這可能是因為丹皮酚具有清除自由基的能力。

對于內生的、外在的毒性化合物如化學致癌劑、活性氧引起的細胞損傷，抗氧化酶可以起到主要的預防作用[8]。SOD 和 GPx具有對活性氧的直接清除作用[9]，GPx的抗氧化能力比SOD更強，能夠對更多的過氧化物進行清除[10-11]。SOD可以清除超氧陰離子自由基和有害的氧化劑[12],作為對付超氧自由基的第一道防線。這些抗氧化酶活動的減少可能是由于DEN代謝過程中自由基的大量產生所導致[13]。本文研究中，模型組動物存在抗氧化酶活動的減少，可能是由于DEN代謝過程中不斷增加的活性氧的產生導致。丹皮酚組抗氧化酶活動增加，這可能是因為丹皮酚對自由基的清除作用。

實驗結果顯示，丹皮酚組的肝功指標和脂質過氧化指標都有所改善，結合病理組織學觀察，說明丹皮酚在一定程度上對大鼠肝癌前病變能起到一定的預防保護作用。其作用機制可能與改善肝功能、抑制脂質過氧化反應，提高抗氧化能力有關。該研究結果對于促進丹皮酚抗肝癌前病變作用機制的深入研究提供了一定的科學依據。

[1] 謝晶日,任公平,李明等.中醫藥防治肝癌前病變機制研究概況[J].中國醫藥導報，2008,5(8):25-26.

[2] Maluccio M, Covey A. Recent Progress in Understanding, Diagnosing, and Treating Hepatocellular Carcinoma[J].CA cancer J Clin.,2012,62(6):394-9.

[3] 國家藥典委員會,中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010: 160-161．

[4] 胡云飛,徐國兵.牡丹皮及其主要成分丹皮酚的藥理作用研究進展[J]. 安徽醫藥,2014,18(4):589-592.

[5] 孫雯辛,永潔龍,凱 花,等. 丹皮酚納米結構脂質載體包封率及載藥量的測定[J].陜西中醫，2014,35(2):226-228.

[6] 宋藝君,劉曉婷,馮麗莉，等.二乙基亞硝胺誘發肝癌前病變大鼠模型的建立[J].世界華人消化雜志,2012,20(27):2562-2569.

[7] Klaunig JE, Kamendulis LM. The role of oxidative stress in carcinogenesis[J]. Ann Rev Pharmacol Toxicol,2004,44:239-67.

[8] Ozen T, Korkmaz H. Modulatory effect of Urtica dioica L (Urticaceae) leaf extract on biotransformation of enzyme systems, antioxidant enzymes, LDH and lipid peroxidation in mice[J]. Phytomedicine,2003,10:405-15.

[9] Byung Pal YU. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species[J]. Physiol Rev,1994,14:139-62.

[10] H. GEDIK. Risk factors for drug resistant bacterial infections: Hospital based study[J]. African Journal of Microbiology Research,2012,6(6)：1190-1196.

[11] A.R. Al-Ajlan. Tobacco smoking vs. lipid profile and anthropometric measures: A cross-sectional study among students in the Riyadh College of Health Sciences[J]. African Journal of Pharmacy and Pharmacology,2012,6(10) :717-723.

[12] Rajeshkumar NV, Kuttan R. Modulation of carcinogenic response and antioxidant enzymes of rats administered with 1,2-dimethylhydrazine by Picroliv[J]. Cancer Lett, 2003,191(2):137-43.

[13] Vásquez-Garzón VR, Arellanes-Robledo J, Garcáa-Román R, et al. Inhibition of reactive oxygen species and preneoplastic lesions by quercetin through an antioxidant defense mechanism[J].Free Radic Res,2009,43(2):128-37.

(收稿2015-05-27；修回2015-07-01)

R258.5

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2015.09.086

*北京中醫藥大學創新團隊基金資助項目(2011-CXD-04)

▲北京中醫藥大學基礎醫學院(北京100029)

□中國醫學科學院藥用植物研究所(北京100193)

主題詞肝腫瘤，實驗性丹皮酚二乙基亞硝胺