烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上皮組織MUC2和TFF3的影響*

惠　毅　閆曙光　李京濤

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

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烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上皮組織MUC2和TFF3的影響*

惠毅閆曙光△李京濤▲

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

目的：觀察烏梅丸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸杯狀細胞分泌MUC2和TFF3蛋白的影響，揭示該方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制。方法：以SD大鼠為研究對象，采用TNBS/乙醇灌腸誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎形成，采用不同劑量的烏梅丸灌胃給藥，ELISA和免疫組化法檢測結(jié)腸上皮組織MUC2、TFF3的含量和表達。結(jié)果：烏梅丸能有效提高潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上皮組織MUC2、TFF3的含量，促進其在上皮組織的表達，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，各治療組間比較有顯著性差異。結(jié)論：烏梅丸有修復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸粘膜屏障的作用，這種作用與劑量成正比關(guān)系，其機制可能與促進杯狀細胞分泌MUC2和TFF3有關(guān)。

腸黏膜屏障分為物理屏障和化學(xué)屏障，化學(xué)屏障主要由腸道上皮細胞所分泌的黏蛋白、防衛(wèi)素等多肽抗菌素構(gòu)成，而杯狀細胞能產(chǎn)生和分泌大多數(shù)的黏蛋白(MUC2)、大量生物活性分子如上皮膜結(jié)合蛋白、三葉因子多肽(TFF3)等[1]。這些物質(zhì)構(gòu)成了腸道的黏液層(化學(xué)屏障)，在腸道和上皮之間起著重要的防御作。MUC2和TFF3是化學(xué)屏障中發(fā)揮防衛(wèi)功能的主要蛋白，通過檢測結(jié)腸上皮組織MUC2和TFF3的含量以及表達部位的變化，可部分反映腸粘膜屏障的功能[2]。烏梅丸是治療UC臨床療效確切的方劑，MUC2和TFF3在UC的發(fā)病以及治療中發(fā)揮著重要作用[3]。烏梅丸對MUC2和TFF3是否有影響，尚無相關(guān)報道，為進一步探討其治療UC機制，我們觀察了烏梅丸對UC大鼠結(jié)腸上皮組織MUC2、TFF3的影響，現(xiàn)報道如下。

1　材　料

1.1實驗動物SPF級SD大鼠，雄性，體重220g±20g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供(合格證號：SCX(陜)2007-001)。

1.2藥物和試劑烏梅丸方組成：烏梅、黃連各16g，干姜10g，黃柏、附子、細辛、桂枝、人參各6g，蜀椒、當歸各4g。以上藥物附子先煎30min，余常規(guī)煎煮，高溫滅菌后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)；MUC2、TFF3 EILSA檢測試劑盒；MUC2、TFF3抗體。

1.3實驗儀器酶標儀：ELX808，美國Bio-Tek公司；超聲波細胞粉碎機：JY92-Ⅱ,寧波新芝生物科技公司；圖像采集系統(tǒng)：NIKON.ACT-1 DXM1200 日本尼康公司；光學(xué)顯微鏡：蔡司光學(xué)儀器(上海)公司。

2　方　法

2.1分組與造模將50只大鼠隨機分成5組：空白組、模型組、烏梅丸大、中、小劑量組，每組10只。除空白組外，其余大鼠禁食24h后，采用經(jīng)腸插管法將50%的TNBS/乙醇溶液按100mg/kg劑量用注射器緩慢推入結(jié)腸，誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎形成。

2.2給藥方法造模后8h后開始灌胃給藥，各中藥治療組按烏梅丸小劑量組13.3g/(kg·d)，中劑量組26.6g/(kg·d)，大劑量組53.2g/(kg·d)；空白組、模型組均給予生理鹽水10mL/(kg·d)，給藥10d。

2.3結(jié)腸黏膜MUC2、TFF3含量的檢測取肛門上約4～6cm間腸段，冰生理鹽水清洗，取結(jié)腸組織0.5g和生理鹽水制成10%勻漿，4000r/min，離心15min，取上清液，按試劑盒說明書檢測MUC2、TFF3含量。

2.4結(jié)腸黏膜MUC2、TFF3蛋白表達的測定取結(jié)腸段，10%中性甲醛液固定24h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，4μm切片，脫蠟脫水后，3%雙氧水室溫孵育10min，蒸餾水沖洗，PBS 浸泡5min，10%山羊血清封閉，室溫孵育10min，分別加入MUC2、TFF3一抗4℃過夜，二抗37℃孵育20min，滴加堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20min，顯色劑顯色3～15min，沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片后采用Zeiss ImergerAl顯微鏡和DXM1200FCCD圖像采集系統(tǒng)觀察并采集圖像。光鏡下陽性反應(yīng)物為棕黃色顆粒，以圖像中最為明顯的黃色顆粒為參照，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus5.1測定其積分光密度。

2.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS18.0處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差表示。多組間比較采用One-WAY ANOVA方差分析，兩組間比較采用SNK法，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)　果

3.1ELISA檢測結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸上皮組織MUC2、TFF3含量明顯降低(P<0.01)，表明造模后，由于杯狀細胞的大量破壞其所分泌的黏蛋白也顯著減少，黏膜屏障功能被損壞；與模型組比較，烏梅丸大、中、小劑量大鼠結(jié)腸上皮組織MUC2、TFF3含量顯著升高(P<0.01)；各治療組間比較，大劑量組大鼠結(jié)腸上皮組織MUC2、TFF3含量最高，其次分別為中、小劑量組(P<0.01)，表明烏梅丸有促進杯狀細胞增殖，促進黏蛋白分泌的作用，且這種作用與劑量成正比關(guān)系。見表1。

表1　　各組大鼠結(jié)腸上皮細胞MUC2、TFF3含量的比較

注：與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01

3.2免疫組化檢測結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸上皮組織MUC2、TFF3表達明顯減弱，陽性細胞分布區(qū)域明顯減少(P<0.05)；給藥后，與模型組比較，烏梅丸大、中、小劑量組MUC2、TFF3表達增強，陽性細胞分布范圍增大(P<0.05)，且與劑量呈正比關(guān)系，見表2，圖1，圖2。

表2　腸上皮細胞MUC2、TFF3蛋白積分光密度(IOD)的比較±s)

注：與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01

4　討　論

潰瘍性結(jié)腸炎的主要臨床表現(xiàn)之一即黏液膿血便，而杯狀細胞是腸道中主要的產(chǎn)黏液細胞，潰瘍性結(jié)腸炎患者以及各種方法誘導(dǎo)的實驗性結(jié)腸炎中常可見到杯狀細胞的形態(tài)學(xué)改變。MUC2和TFF3是杯狀細胞特異表達的分泌性蛋白。MUC2對腸黏膜有保護作用，一旦MUC2的質(zhì)和量發(fā)生變化，腸黏膜失去保護，導(dǎo)致黏膜屏障受損，通透性增高使腸腔內(nèi)的抗原、內(nèi)毒素等促炎癥物質(zhì)進入到黏膜固有層，最終誘發(fā)免疫反應(yīng)，形成腸道炎癥。MUC2的這種作用也進一步被基因敲除實驗證實，當敲除小鼠的MUC2 基因可誘發(fā)自發(fā)性結(jié)腸炎形成。臨床研究表明潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸MUC2表達不但明顯減少，而且MUC2的表達與病情活動性(病情輕重、內(nèi)鏡分級、組織學(xué)分級)之間有一定關(guān)系。三葉因子3(Trefoil factor 3,TFF3)是由杯狀細胞分泌的小分子蛋白，是腸道粘液層中的重要組成部分，具有維持粘膜表面的完整性，促進上皮重建，抗凋亡、促分裂、促運動的作用。眾多研究發(fā)現(xiàn)杯狀細胞不僅限于分泌粘液的簡單生理功能，而是直接參與了潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病。因此，恢復(fù)杯狀細胞數(shù)量，促進MUC2和TFF3的分泌，從而恢復(fù)黏膜屏障的防御功能可能成為治療潰瘍性結(jié)腸炎的有效方法之一[4]。通過本次研究，表明烏梅丸能促進結(jié)腸黏膜化學(xué)屏障的修復(fù)，同時使MUC2、TFF3蛋白表達升高，而這兩種蛋白為杯狀細胞所分泌，因此，烏梅丸可能通過促進杯狀細胞的增殖和分泌，促進結(jié)腸黏膜屏障的修復(fù)。

[1] Reid G,Carey F A. Pathology of idiopathic inflammatory bowel disease[J].Surgery (Oxford), 2011, 29(8): 362-365.

[2] Noah T K, Donahue B, Shroyer N F.Intestinal development and differentiation[J].Experimental cell research, 2011.317(19): 2702-2710

[3] 閆曙光,惠毅,周永學(xué),等.烏梅丸方加減治療潰瘍性結(jié)腸炎的療效評價與Meta分析[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2013 ，19(3): 296-298.

[4] Gersemann M, Stange E F, Wehkamp J. From intestinal stem cells to inflammatory bowel diseases[J]. World journal of gastroenterology: WJG, 2011, 17(27): 3198.

(收稿2015-03-22；修回2015-04-30)

R573.1

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2015.09.085

*陜西省科技廳項目(2013JQ4006)

陜西中醫(yī)學(xué)院科研創(chuàng)新基金項目(14XJZR02)

△陜西省胃腸病證方藥省級重點研究室(咸陽712046)

▲陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽 712046)

主題詞 潰瘍性結(jié)腸炎 烏梅丸 杯狀細胞 MUC2 TFF3