腫瘤壞死因子α與白介素17在銀屑病中的表達

吳方毅任妮麗

腫瘤壞死因子α與白介素17在銀屑病中的表達

吳方毅1任妮麗2*

目的： 檢測TNF-α與IL-17在銀屑病皮損中的表達。方法： ELISA檢測68例銀屑病患者與28例對照（非銀屑病患者）血清TNF-α和IL-17的表達；免疫印跡法檢測局部皮損、患者正常皮膚及對照者皮膚中TNF-α和IL-17的表達；qT-PCR檢測TNF-α和IL-17的mRNA表達。結果： 銀屑病患者血清TNF-α、IL-17的表達均高于對照組（P＜0.05）；皮損組織中TNF-α、IL-17蛋白及mRNA的表達均高于患者正常皮膚及對照組皮膚（均P＜0.05）。結論： TNF-α與IL-17在銀屑病的發展中可能相互作用。

TNF-α； IL-17； 銀屑病

銀屑病的發病率約1～5%，1，2銀屑病的病因還不完全清楚，普遍認為是一種自身免疫性的炎性疾病。銀屑病的全基因組關聯已經確定，這些關聯的基因位點參與了皮膚的屏障功能（LCE3A，LCE3C和LCE3D）、T-細胞信號轉導（IL-2，IL-17，IL-21，IL-13，IL-12B，IL-23A，IL-23R等）和抗原提呈（ERAP1和HLA-C）。3，4在這些因子中，細胞因子白介素-17在銀屑病的發病機制中具有至關重要的作用。銀屑病斑塊顯示活化的T細胞，特別是Th17型的浸潤放大了炎性反應，活化的T細胞分泌的重要細胞因子包括IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-17，腫瘤壞死因子（TNF）-α，干擾素γ，表皮生長因子，成纖維細胞生長因子和血小板介導的生長因子。5TNF-α是一種具有廣泛生物學活性的細胞因子，在異常情況下，特別是其水平升高時會導致免疫病理反應，如類風濕性關節炎、骨關節炎、銀屑病、炎性腸炎、克朗病等。新近研究發現，6銀屑病患者皮損、血清、關節腔滑膜或細胞培養上清液中TNF-α的水平較正常對照組明顯升高，經治療后會有不同程度的下降，且銀屑病患者病情嚴重程度與TNF-α的水平呈正相關，提示TNF-α在銀屑病發病機制中有重要作用。IL-17和TNF-α的組合表現出復雜的相互作用與增強基質的形成，7堿性磷酸酶活性，并具有降低Schnurri-3表達的凈效應。但兩者在銀屑病中的共表達及意義尚無相關研究。本文主要研究IL-17與TNF-α在銀屑病中的共表達及意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 TNF-α抗體購自于 saierbio（貨號：ReSRP00068），IL-17抗體購自于 BD（貨號：559501），IL-17A ELISA試劑盒購自于Enzo（貨號：ADI-900-177），TNF-αELISA試劑盒購自于Diaclone（貨號：950.090.048）

1.1.2標本 收集我科2000-2013年經病理證實為銀屑病的患者資料68例，其中男31例，女37例，年齡20～75歲，平均38歲，收集外周靜脈血液標本，及背部或腹部破損的皮損組織（A組），取距皮損處大于12 cm的正常皮膚送檢作對照（B組）。同期我院整形美容科門診28例患者廢棄的正常皮膚作為正常皮膚對照（C組）。收集的皮膚做液氮冷凍保存。收集的銀屑病患者外周血液離心后取血清冷凍保存，同期體檢門診健康人群血常規血清液做健康對照。所有病例均有患者簽字的知情同意書和有創操作同意書。

1.2方法

1.2.1運用ELISA檢測循環血中TNF-α/IL-17的表達水平，采用人血清TNF-αELISA試劑盒以及人血清IL-17 ELISA試劑盒，450 nm紫外線下檢測，8各種實驗要求和步驟嚴格按照說明書進行，計算各樣本TNF-α/IL-17蛋白數值乘以稀釋倍數，取得TNF-α/ IL-17蛋白的血漿濃度。

1.2.2Western檢測銀屑病患者局部皮損組織、皮旁組織及正常皮膚組織中的TNF-α/IL-17表達將皮膚組織收集到的勻漿液進行免疫印記法9檢測。TNF-α/IL-17抗稀釋度分別為1∶400、1∶600。圖像分析系統掃描分析各條帶灰度值，結果取被檢條帶與內參條帶的灰度值之比。

1.2.3運用qT-PCR檢測銀屑病患者局部皮損組織、皮旁組織及對照皮膚組織中TNF-α/IL-17的mRNA表達水平，剪綠豆大皮損樣品，加入1 mL Trizol，勻漿器勻漿。加入200μL氯仿，輕輕顛倒數次混勻，室溫放置5 min，12 000 rpm 15 min 4℃。轉上層水相（約400μL）于新1.5 mL EP管中，加入400μL異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，12 000 rpm 10min 4℃。棄上清，沉淀用預冷的70%無水乙醇洗3次，空氣干燥5～10 min，溶于20μL DEPC水中。分光光度計測定RNA濃度。將所得到的cDNA做10倍稀釋，取4μL進行逆轉錄，10Green/Flouresceinq PCR Master Mix（2X）10μL，H2O 5.2μL；DL2000：2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp；Cycling conditions，40 cycles of 95℃-30 s，60℃-30 s。引物設計見表1：

表1　小鼠肺腺癌組織中ERβ、ERβ2和IGF-1R的FQ-PCR引物序列

1.2.4統計學方法 統計學分析采用SPSS 19.0軟件。使用卡方檢驗分析TNF-α和IL-17在銀屑病患者及對照組中表達的差異。銀屑病患者血液及皮損組織中TNF-α和IL-17之間進行表達相關性分析。P＜0.05為差異有顯著性統計學意義。

2　結果

2.1銀屑病患者與健康人群循環血中TNF-α/IL-17表達水平的比較 采用ELISA試劑盒檢測銀屑病患者與健康人群循環血中TNF-α/IL-17表達，發現TNF-α/IL-17在銀屑病患者血液中的表達均高于健康人群（表2，圖1），表明TNF-α/IL-17在銀屑病患者血液中存在共同高表達現象。

表2　不同人群TNF-α/IL-17表達水平的比較

圖1　不同人群血液中TNF-α/IL-17表達的比較

2.2局部皮損組織、皮損旁組織及健康皮膚組織中的TNF-α/IL-17表達 運用Western-blot檢測局部皮損組織、皮損旁組織及健康皮膚組織中的TNF-α/ IL-17表達，發現TNF-α/IL-17蛋白水平在皮損組織中顯著高于皮損旁組織及健康皮膚組織（均P＜0.05），對照組與皮旁組織無統計學意義。表明TNF-α/IL-17存在相互作用的分子基礎，在銀屑病中炎癥因子與TNF-α可能存在協同促進作用，見圖2。

圖2　不同人群不同組織TNF-α/IL-17蛋白水平的比較

2.3局部皮損組織、皮損旁組織及健康皮膚組織中的TNF-α/IL-17 mRNA的表達 為了在mRNA水平進一步研究局部皮損組織、皮損旁組織及健康皮膚組織中的TNF-α/IL-17表達，我們所取得的標本做TNF-α/IL-17的FQ-PCR分析。FQ-PCR結果發現TNF-α/IL-17分別在其局部皮損組織顯著高于對照組和皮損旁組織（P＜0.05），對照組與皮旁組織無統計學意義。這些表達趨勢與蛋白水平相一致，進一步表明TNF-α/IL-17存在相互作用的分子基礎，見圖3。

圖3　不同人群不同組織TNF-α/IL-17 mRNA水平的比較（2-△△t=△t=實驗組含量-內參含量；△△t為平均值，例如△△t（IL-8）=△t（IL-8）-△t（對照組）；2-△△t平均值=2-△△t，即2-△△t的平均值）

3　討論

白細胞介素-17（IL-17A）屬于六配位成員（IL-17A和IL-17F）促炎細胞因子，IL-17是該系列的原型。這種二聚體糖蛋白在循環中存在同型二聚體IL -17A或異源二聚體IL-17F。11-13在銀屑病的發病機制研究中，無論是先天還是后天性免疫系統中所涉及的銀屑病，過度增殖角質形成細胞是通過從T細胞的細胞因子驅動的，產生進一步的促炎性細胞因子。銀屑病斑塊顯示活化的T細胞，特別是Th17細胞的浸潤放大炎性反應，產生大量的IFN-γ，IL-17，IL-22和TNF-α。這顯示出IL-17和TNF-α均在銀屑病中具有重要作用。

在本實驗中發現，銀屑病患者循環血液中IL-17和TNF-α均高于對照組，并且在蛋白水平和mRNA水平同樣顯示出局部皮損組織中均高于皮旁組織及正常皮膚組織，說明IL-17和TNF-α在銀屑病患者有顯著高表達現象。一個更加關鍵的報道是14TNF-α抑制BMP2表達時增強了IL-17的分泌。TNF-α與IL-17共同激活NF-κB和AP-1，15，16IL-17上的hMSCs增加TNF-α的作用效率，14為此我們推測在銀屑病中可能也存在這種交叉反應。

初步實驗中我們發現IL-17和TNF-α在銀屑病中均顯著高表達，這表明兩信號通路存在相互作用的分子基礎。為了進一步研究IL-17和TNF-α在銀屑病中是否具有相互作用，我們對比銀屑病患者循環血液中IL-17和TNF-α的表達，并進行相關性分析，發現兩者的表達具有相關性。在后續的免疫印跡實驗和qT-PCR實驗中也發現IL-17和TNF-α在銀屑病患者皮損組織中的表達具有相關性，并且在局部皮損組織、皮旁組織及對照皮膚組織中表現出明顯的梯度趨勢。這些結果表明IL-17和TNF-α在銀屑病進展中可能存在相互作用。

綜上所述，本文初步探討了銀屑病患者循環血液及局部皮損組織中TNF-α/IL-17的表達，發現TNF-α/IL-17在銀屑病患者顯著高表達，且兩者具有共表達趨勢；TNF-α/IL-17在銀屑病的進展中可能存在相互作用。由于本文只是初步探討TNF-α/IL-17的表達，為研究兩者在銀屑病中相互作用的分子基礎提供理論依據，盡管結果表明TNF-α/IL-17兩信號通路可能存在相互作用，但是還不足以證實，這有待于下一步的深入研究，其結果可能為銀屑病的多靶點聯合治療提供新的選擇。

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（收稿：2015-01-19）

·病例報告·

The common expression of TNF-αand IL-17 in psoriasis and its significance

WU Fang-yi，REN Ni-li.Department ofDermatology，Shiyan People'sHospital，Affiliated to Hubei University ofMedicine，Shiyan，442000

Objective：To detect the expression of TNF-αand IL-17 in the patientswith psoriasis.M ethods：The serum levels of TNF-αand IL-17 were detected in 68 patients with psoriasis and 28 controls from cosmetic surgery department.The expression of protein TNF-αand IL-17 in the patients'lesions and normal skin of the patients aswell as the skin of normal controlswas detected by ELISA and themRNA of TNF-αand IL-17 was detected by qT-PCR.Results：The levels of serum TNF-αand IL-17 were higher in the patients than in controls.The levels of protein and mRNA expression of TNF-αand IL-17 were higher in the patients' lesions than in thenormalskin of the patientsand controls.Conclusion：TNF-αand IL-17may be interacted in the progress of psoriasis.

TNF-α；IL-17；psoriasis

1湖北醫藥學院附屬人民醫院皮膚科，十堰，442000

2湖北醫藥學院附屬人民醫院醫務科，442000