內蒙古漢族尋常型銀屑病GJB2基因rs72474224位點檢測

劉 佳 黃艷平 丁文媛 孫志強 楊俊君 韓建文呂新翔 烏日娜

內蒙古漢族尋常型銀屑病GJB2基因rs72474224位點檢測

劉 佳 黃艷平 丁文媛 孫志強 楊俊君 韓建文*呂新翔 烏日娜*

目的： 檢測內蒙古漢族尋常型銀屑病GJB2基因rs72474224位點的多態性。方法： 提取294例尋常型銀屑病患者及287名正常對照外周血DNA，利用PCR和連接酶檢測反應檢測GJB2基因rs72474224的多態性。結果： SNP rs72474224等位基因T在病例組和對照組中的頻率分別為0.03571和0.01045，差異具有統計學意義（P=0.004267）。結論： GJB2基因多態性rs72474224可能與內蒙古漢族人群尋常型銀屑病的易感性相關。

尋常型銀屑病； GJB2

銀屑病是一種以紅斑、鱗屑為主要表現的慢性增殖性炎癥性皮膚病，根據臨床表現不同主要分為4種類型，其中以尋常型銀屑病最多見，占所有病例90%以上。在中國銀屑病發病率大約為0.123%。1近年來，遺傳關聯研究發現一大批銀屑病相關的易感基因。22014年，Tang等3通過全基因組外顯子測序方法發現GJB2基因的一個錯義突變（rs72474224，c.324C＞T，p.Val37Ile）與中國漢族人群銀屑病易感性相關。為進一步證實其研究結果，本研究利用連接酶檢測反應（ligase detection reaction，LDR）對rs72474224進行基因分型，探討其與漢族人群尋常型銀屑病的相關性。

1　資料和方法

1.1資料 研究對象：從內蒙古醫科大學附屬醫院收集尋常型銀屑病患者294例，正常對照287例。經知情同意并簽字后抽取外周靜脈血5 m L，EDTA抗凝，置于-80℃冰箱保存備用。所有患者經臨床及病理證實診斷，符合尋常型銀屑病診斷標準。所有對照排除銀屑病及其他自身免疫疾病，排除銀屑病家族史。本研究經過內蒙古醫科大學附屬醫院倫理委員會通過，并在實施過程中遵守赫爾辛基宣言。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 利用AxyPrep，AP-MX-BL -GDNA-25基因組DNA提取試劑盒提取患者及對照基因組DNA，利用分光光度儀檢測260 nm和280 nm吸光度，計算DNA濃度。并利用凝膠電泳檢測DNA質量，所有DNA樣本均合格。

1.2.2引物及探針的合成 利用 Primer 3 online（Version 0.4.0）軟件（http：//frodo.wi.mit.edu/）和Oligo（Version 6.31）（Molecular Biology Insights Inc.，USA）軟件設計特異性引物和LDR探針，針對該基因位點設計兩條引物，要盡量保證所有基因位點的引物T值相同，PCR反應引物序列見表1。根據LDR探針設計原則設計LDR的上下游探針，4上游探針5'端用磷酸化修飾，LDR反應探針序列見表2。

表1　PCR反應引物序列

1.2.3多重PCR反應 PCR反應體系為（20μL） 1 μL模板，2μL Buffer緩沖液，0.6μL Mg2+，2μL dNTP，0.2μL TaqDNA聚合酶，2μL引物混合液，加水補足。PCR反應條件：95℃預變性2 min；94℃30 s。56℃退火1.5 min。65℃ 30 s，40個循環。最后65℃延伸10 min。

1.2.4多重LDR反應 LDR反應體系為（10μL）

1μL Buffer緩沖液，1μL探針混合液，0.05μL Taq DNA連接酶，4μL PCR產物，加水補足10μL。探針混合液濃度為2 pmol/μL。LDR反應條件：95℃ 2 min預變性，94℃15 s，50℃ 25 s，進行40個循環。

1.2.5測序與基因分型 反應產物經過，ABI3730測序儀測序分析，最后用Genemapper軟件進行數據分析，判讀各位點上的基因分型。

1.2.6統計學方法 對SNP數據質控、統計分析利用PLINK 1.07軟件完成（http：//pngu.mgh.harvard. edu/purcell/plink/）。5計算其等位基因頻率，病例組及對照中分別進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。卡方檢驗（χ2）比較病例組及對照組等位基因頻率，并計算等位基因的相對危險度估計值比值比OR及其95%可信區間（95%CI）。Fisher精確概率法比較病例組與對照組間的基因型頻率，所有統計檢驗均為雙側概率檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1病例組及對照組質控 病例及對照樣本在性別及年齡方面無顯著性差異，具有可比性（P＞0.05），樣本信息見表3。該SNP在對照中符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P=1）。

2.2等位基因頻率比較 經PLINK 1.07軟件統計分析，SNP rs72474224的等位基因T在病例組和對照組中的頻率分別為0.03571和0.01045，兩組之間等位基因分布頻率差異有統計學意義（P=0.004267，OR= 3.51，95%CI：1.41～8.75）。根據患者發病年齡進行分層分析發現，等位基因T在早發型銀屑病（發病年齡小于40歲）中的頻率更高（0.04545），明顯高于對照組（P=0.0005621，OR=4.51，95%CI：1.77～11.46），而晚發型銀屑病（發病年齡≥40歲）中的等位基因頻率與對照組無顯著性差異（P=0.5648）（表4）。

2.3基因型頻率分布情況 為分析該SNP的遺傳模式，分別按照累加、隱性、顯性三種模式下比較病例組與對照組的基因型頻率。利用Fisher確切概率法進行分析，發現在顯性模式下最為顯著（P=0.009），而且在早發型銀屑病中差異更為顯著（P=0.002），晚發型銀屑病與對照組間基因型分布在三種模式下均無顯著性差異（P＞0.05）（表5）。

表3　尋常型銀屑病及對照組樣本信息

表4　尋常型銀屑病和對照中rs72474224等位基因頻率分布

表5　尋常型銀屑病和對照中rs72474224基因型分布

3　討論

2010年，Sun等的全基因組關聯分析研究首次報道GJB2基因多態性與銀屑病易感性相關。62014年全基因組外顯子測序研究3再次證實GJB2基因與銀屑病的關系，發現位于GJB2基因上錯義突變與銀屑病相關聯。

GJB2基因定位于13q11-12區域，全長為4804 bp，編碼區為678 bp，由兩個外顯子組成，即一個簡短的外顯子1（exon1）和一個長蛋白編碼外顯子 2（exon2），編碼區主要存在于exon2，編碼在耳蝸和表皮中表達的β類縫隙連接蛋白Connexin26（Cx26）。Cx26蛋白包括 2個胞外域（extracellular domain，EC），3個胞內域（intracellular，IC），4個跨膜域（tans menbrane domain，TM）、細胞質氨基末端和羧基末端，它存在于很多的細胞和組織中，包括耳蝸，手掌和腳掌，毛囊和汗腺。7GJB2基因突變包括移碼突變、缺失、插入等，可產生有功能缺陷或無功能的Connexin26蛋白，在其蛋白翻譯及通道蛋白聚集水平產生影響。這個域的突變會導致Cx26的渠道活動受到干擾和聽覺器官的間隙連接因子的功能缺陷。既往研究發現Cx26的突變均與常染色體隱性非綜合性耳聾（ARNHL），常染色體顯性綜合性耳聾（ADHL）和掌跖角化癥（PPK）有關。8Bowcock等發現Cx26在銀屑病皮損中表達上調。9缺乏轉錄因子Kruppel-likefactor 4（Klf4）的缺陷小鼠在表皮屏障的表達上產生嚴重缺陷。Klf4缺陷的新生兒皮膚也顯示出與斑塊狀銀屑病皮損相似的基因表達改變，并且縫隙連接蛋白Cx26的表達也顯著上調。10免疫組化法證實Cx26在銀屑病患者皮損區表皮全層有表達，且蛋白表達量較非皮損區及正常對照顯著增加。8Cx26轉基因鼠的皮膚出現銀屑病樣皮損，并具備角質形成細胞過度增殖、分化不全及皮膚屏障功能缺陷等銀屑病皮損特征。8這些研究都提示GJB2基因與銀屑病的發病密切相關，可能在維持角質形成細胞增殖和分化平衡中發揮重要作用。

本研究結果顯示rs72474224在銀屑病中突變頻率高于正常人，與Tang等3研究結果類似，均能增加銀屑病發病風險。證實了其與中國漢族人尋常型銀屑病的相關性，更進一步提示GJB2基因在銀屑病發病機制中發揮著重要作用。但是該錯義突變如何影響Connexin26蛋白的翻譯及功能仍需要進一步功能學研究。

1 Zhang XJ，HuangW，Yang S，etal.Psoriasis genome-wide association study identifies susceptibility variantswithin LCE gene cluster at 1q21.Nat Genet，2009，41（2）：205-210.

2 Zhang X.Genome-wide association study of skin complex diseases.JDermatol Sci，2012，66（2）：89-97.

3 Tang HY，Jin X，Li Y，et al.A large-scale screen for coding variants predisposing to psoriasis.Nat Genet，2014，46（1）：45-50.

4 Yi P，Chen Z，Yu L，et al.Development of a PCR/LDR/capillary electrophoresis assaywith potential for the detection of a beta-thalassemia fetalmutation inmaternal plasma.JMatern Fetal Neonatal Med，2010，23（8）：920-927.

5Purcell S，Neale B，Todd-Brown K，et al.PLINK：a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses.Am JHum Genet，2007，81（3）：559-575.

6 Sun LD，Cheng H，Wang ZX，etal.Association analyses identify six new psoriasis susceptibility loci in the Chinese population. Nat Genet，2010，42：1005-1009.

7 Evans WH，Martin PE.Gap junctions：structure and function（Review）.Mol Membr Biol，2002，19（2）：121-136.

8 Lucke T，Choudhry R，Thorn R，etal.Upregulation of connexin 26 is a feature of keratinocyte differentiation in hyperproliferative epidermis，vaginal epithelium，and buccal epithelium.J Invest Dermatol，1999，112：354-361.

9 Lizzul PF，Aphale A，Malaviva R，et al.Differential expressionof phosphorylated NF-kappaB/RelA treatmentwith etanercept.J Invest Dermatol，2005，124（6）：1275-1283.

10 Hollox EJ，Huffmeier U，Zee uwen PL，etal.Psoriasis is associated with increased beta-defensin genomic copy number.Nat Genet，2008，40（1）：23-25.

（收稿：2015-03-17 修回：2015-03-19）

·病例報告·

Detection of the polym orphism s of GJB2 gene rs72474224 in patients w ith psoriasis vu lgaris

LIU Jia，HUANG Yan-ping，DINGWen-yuan，et al.Department ofDermatology，the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot，010050

Objective：To detect the polymorphisms of GJB2 gene rs72474224 in patients with psoriasis vulgaris in Han population in Inner Mongolia.M ethods：DNA was extracted from the peripheral blood of 294 patients and 287 controls.The polymorphisms of GJB2 gene rs72474224 were genotyped by PCR-based ligase detection reaction（PCR-LDR）.Results：The genotype frequencies of T in patients and controlswere0.0357 and 0.01045，with a significant difference（P=0.004267）.Conclusion：The polymorphism of GJB2 gene rs72474224 is associated with psoriasis vulgaris in Han population in Inner Mongolia.

psoriasis vulgaris；GJB2

國家自然科學基金（編號：31160192）

內蒙古醫科大學青年創新基金項目（編號：NY2011QN005）

內蒙古自治區衛生和計劃生育委員會醫療衛生科研計劃項目（編號：201303057）

內蒙古自治區高等學校“青年科技英才支持計劃”（編號：NJYT-14-B17）

內蒙古醫科大學附屬醫院皮膚科，呼和浩特，010050