葉瓜參長(zhǎng)鏈堿抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化作用機(jī)制

毛　磊，徐　慧，田迎櫻，徐　杰，王玉明，王靜鳳*，薛長(zhǎng)湖

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島　266003）

葉瓜參長(zhǎng)鏈堿抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化作用機(jī)制

毛磊，徐慧，田迎櫻，徐杰，王玉明，王靜鳳*，薛長(zhǎng)湖

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266003）

目的：研究葉瓜參長(zhǎng)鏈堿（long-chain base from the sea cucumber Cucumaria frondosa，Cf-LCB）對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的作用，并探 討其作用機(jī)制。方法：以四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測(cè)Cf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖活性的影響；采用傳統(tǒng)雞尾酒法誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，分別采用油紅O染色和甘油三酯（triglycerides，TG）含量測(cè)定法評(píng)價(jià)其對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響；反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantity real-time reverse transcript polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein alpha，C/EBPα）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors gamma，PPARγ）以及WNT/β-catenin通路關(guān)鍵基因WNT10b（wingless-type MMTV integration site family members）、卷曲蛋白1（frizzled protein1，F(xiàn)Z1）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6（LDL-receptor-related protein6，LRP6）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的mRNA表達(dá)水平；Western blotting法檢測(cè)WNT/β-catenin通路關(guān)鍵基因LRP6和β-catenin的蛋白表達(dá)量。結(jié)果：Cf-LCB能顯著抑制3T3-L1前 脂肪細(xì)胞的增殖；抑制3T3-L1細(xì)胞脂滴形成以及C/EBPα和PPARγ mRNA表達(dá)；顯著上調(diào)WNT/β-catenin通路關(guān)鍵基因FZ1、LRP6和β-catenin mRNA表達(dá)，對(duì)WNT10b的表達(dá)無(wú)影響；顯著促進(jìn)LRP6和β-catenin的蛋白表達(dá)，提高核內(nèi)β-catenin含量。結(jié)論：Cf-LCB能夠顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化，其作用機(jī)制與激活WNT/β-catenin通路有關(guān)。

葉瓜參；長(zhǎng)鏈堿；3T3-L1前脂肪細(xì)胞；分化；WN T/β-catenin信號(hào)通路

肥胖是胰島素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病等代謝綜合征的共同誘因，給人類(lèi)健康和社會(huì)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重危害［1］。研究表明，脂肪細(xì)胞過(guò)度分化是引起肥胖的重要原因［2］，因此，控制脂肪細(xì)胞分化是預(yù)防和治療肥胖的重要途徑。Ahn等［3］研究發(fā)現(xiàn)WNT/β-catenin通路是脂肪細(xì)胞分化的“總開(kāi)關(guān)”，WNT/β-catenin通路被激活后，最終通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT/ enhancer binding protein alpha，C/EBPα）和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors gamma，PPARγ）的表達(dá)抑制脂肪細(xì)胞分化。

長(zhǎng)鏈堿（long-chain base，LCB）是鞘脂的特征性結(jié)構(gòu)，屬于最簡(jiǎn)單的鞘脂類(lèi)化合物［4］。海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的LCB更易被機(jī)體吸收，且具有更強(qiáng)的生理活性［5］。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于海參LCB的研究較少，主要發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤［6-7］、改善糖脂代謝［4］功能。然而，關(guān)于海參長(zhǎng)鏈 堿對(duì)脂肪細(xì)胞功能影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

不同海參中鞘脂含量差異較大，有研究表明，葉瓜參是鞘脂含量較高的物種，可作為制備LCB的原料［8］。徐杰［9］通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析確認(rèn)葉瓜參長(zhǎng)鏈堿（long-chain base from the sea cucumber Cucumaria frondosa，Cf-LCB）主要包括d18∶2、d17∶1、d18∶3和d19∶34 種，其相對(duì)分子質(zhì)量范圍為238.4～320.5。本實(shí)驗(yàn)從葉瓜參中制備得長(zhǎng)鏈堿，研究Cf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化的作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討，為葉瓜參長(zhǎng)鏈堿的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，為預(yù)防和治療肥胖等代謝綜合征藥物的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

葉瓜參（Cucumaria frondosa）干品，購(gòu)自青島市南山水產(chǎn)市場(chǎng)；3T3-L1前脂肪細(xì)胞株，購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2試劑

DMEM培養(yǎng)基美國(guó)Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）美國(guó)Hyclone公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、胰島素、油紅O染料、胰蛋白酶美國(guó)Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）活性檢測(cè)試劑盒南京建成生物工程研究所；甘油三酯（triglycerides，TG）測(cè)定試劑盒北京Aibio公司；Trizol美國(guó)Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶日本TaKaRa公司；SYBR Green熒光染料瑞士Roche公司；C/EBPα抗體、PPARγ抗體美國(guó)Abcam公司；30%丙烯酰胺、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、RIPA裂解液、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）北京索萊寶科技有限公司；超敏發(fā)光液北京普利萊基因有限公司；脫脂牛奶美國(guó)BD公司；所有檢測(cè)基因引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3儀器與設(shè)備

2711型CO2培養(yǎng)箱德國(guó)Heraeus公司；DL-CJ-1N型超凈工作臺(tái)北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；IX51型倒置顯微鏡日本Olympus公司；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；iQ5型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantity real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀、680型酶標(biāo)儀美國(guó)Bio-Rad公司；DYCP-40C型半干型轉(zhuǎn)膜工作儀、WD-9405A型脫色搖床北京六一儀器廠；EPS 600型電泳儀上海天能科技有限公司；PVDF膜美國(guó)Milipore公司；JS-780型全自動(dòng)凝膠成像分析儀上海培清科技有限公司；Laborota 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國(guó)Heidolph公司；1260型高效液相色譜儀美國(guó)Agilent公司。

1.4方法

1.4.1Cf-LCB的制備

稱(chēng)取1 kg葉瓜參粉末，用4.5 L氯仿-甲醇（2∶1，V/V）浸提12 h，過(guò)濾。反復(fù)浸提3 次，合并浸提液，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得脂質(zhì)粗提物。將脂質(zhì)粗提物經(jīng)4 mol/L KOH在37 ℃條件下皂化1 h，冷卻后用氯仿萃取3 次（氯仿、甲醇、水的體積比為2∶1∶0.9），收集下層組分，減壓濃縮至干。然后，用1 mol/L鹽酸80 ℃酸解反應(yīng)16 h，冷卻后用相同體積的正己烷萃取3 次，舍棄正己烷相，并調(diào)pH值至10。最后以0.5 倍體積乙醚萃取得到長(zhǎng)鏈堿粗提物。采用正向硅膠柱層析法分離得到較純的Cf-LCB。經(jīng)高效液相色譜法分析，其純度在86%以上。實(shí)驗(yàn)前，Cf-LCB溶解于DMSO中，且細(xì)胞培養(yǎng)液中DMSO的終體積分?jǐn)?shù)小于0.1%。

1.4.23T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)與分化

3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 μg/mL鏈霉素以及100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，以0.25%胰酶消化傳代，于37 ℃、5% CO2且相對(duì)濕潤(rùn)的孵箱中常規(guī)傳代貼壁培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔接種于24 孔板中。待細(xì)胞融合后接觸抑制48 h（記為分化第0天），將細(xì)胞培養(yǎng)液換為含有0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L DEX、10 μg/mL胰島素和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，再換用含10 μg/mL胰島素和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。以后每2 d更換1 次完全培養(yǎng)液（含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基），并于第8天檢測(cè)脂肪含量。

1.4.3Cf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖活性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔接種于96 孔板中。貼壁培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為對(duì)照組和Cf-LCB低、中、高劑量組，其中對(duì)照組不添加Cf-LCB，Cf-LCB低、中、高劑量組中Cf-LCB的含量分別為25、50、100 μg/mL，每組4 個(gè)復(fù)孔，每孔200 μL。培養(yǎng)96 h后，采用MTT法測(cè)定各處理組細(xì)胞在570 nm波長(zhǎng)處吸光度（A570nm），按照下式計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.4.4Cf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶活性的影響

細(xì)胞接種及加樣方法同1.4.3節(jié)。3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)Cf-LCB作用96 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定上清液中LDH活性。

1.4.5Cf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

3T3-L1前脂肪細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于24 孔板中，按1.4.2節(jié)所述方法誘導(dǎo)細(xì)胞分化，在細(xì)胞分化第0天將細(xì)胞分為對(duì)照組和Cf-LCB低、中、高劑量組，加樣量同1.4.3節(jié)。將分化第8天的脂肪細(xì)胞用10%多聚甲醛固定1 h，0.5%油紅O染色30 min后，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。拍照結(jié)束后，每孔加入800 μL異丙醇溶解與脂肪細(xì)胞結(jié)合的油紅O染液，并于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，半定量檢測(cè)脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量。

1.4.6脂肪細(xì)胞中TG含量測(cè)定

3T3-L1前脂肪細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于24 孔板中，按1.4.2節(jié)所述方法誘導(dǎo)細(xì)胞分化。至分化第8天，將脂肪細(xì)胞以0.5% BSA饑餓處理12 h，將細(xì)胞分為對(duì)照組和Cf-LCB低、中、高劑量組，加樣量同1.4.3節(jié)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用冰預(yù)冷的裂解液裂解細(xì)胞30 min，收集細(xì)胞裂解液，離心后收集上清液，采用試劑盒測(cè)定上清液中TG及蛋白質(zhì)含量。細(xì)胞中TG含量表示為T(mén)G質(zhì)量/蛋白質(zhì)質(zhì)量（mg/mg）。

1.4.7qRT-PCR法檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因C/EBPα、PPARγ和WNT/β-catenin通路關(guān)鍵基因WNT10b、FZ1、LRP6、β-catenin mRNA的表達(dá)

3T3-L1前脂肪細(xì)胞以4.5×104個(gè)/孔接種于6 孔板中，按1.4.2節(jié)所述方法誘導(dǎo)細(xì)胞分化，于分化第0天時(shí)，分為對(duì)照組和Cf-LCB高劑量組（100 μg/mL）。分別至分化第0、2、4、8天時(shí)，采用Trizol法提取細(xì)胞中RNA。每組取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，qRT-PCR法檢測(cè)C/EBPα、PPARγ、WNT10b（wingless-type MMTV integration site family members）、卷曲蛋白1（frizzled protein1，F(xiàn)Z1）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6（LDL-receptor-related protein6，LRP6）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的mRNA表達(dá)。以β-actin作為內(nèi)參校正基因，基因的相對(duì)表達(dá)量以目的基因表達(dá)量/ β-actin表達(dá)量表示，引物序列見(jiàn)表1。

表1　3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化和WNT/ -catenin通路關(guān)鍵基因引物序列Table 1 Primer sequences of the key factors for adipocytes differentiation and WNT/ -catenin pathway

1.4.8Western blotting法檢測(cè)WNT/β-catenin通路關(guān)鍵基因蛋白表達(dá)

3T3-L1前脂肪細(xì)胞以4.5×104個(gè)/孔接種于6 孔板中，按1.4.2節(jié)所述方法誘導(dǎo)細(xì)胞分化，于分化第0天時(shí)，分為對(duì)照組和Cf-LCB高劑量組（100 μg/mL）。于分化第4天時(shí)，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白和細(xì)胞核蛋白。采用Western blotting法測(cè)定LRP6、β-catenin的蛋白表達(dá)量。以β-actin作為總蛋白內(nèi)參，TATA結(jié)合蛋白（TATA-binding protein，TBP）為核蛋白內(nèi)參，蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)以目的蛋白表達(dá)量/β-actin（TBP）表達(dá)量表示。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1Cf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響

圖1　1　CfCf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1　Effect of Cf-LCB on the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes

由圖1可知，Cf-LCB作用96 h后，能極顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖（P＜0.01），平均抑制率為20.07%。

2.2Cf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的毒性作用

LDH廣泛存在于所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到損傷時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的LDH會(huì)釋放到培養(yǎng)液中［10］，因此，測(cè)定培養(yǎng)液中LDH活性可以反映受試物對(duì)細(xì)胞的損傷情況［11］。由圖2可知，Cf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性無(wú)顯著影響，說(shuō)明其對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞無(wú)毒性作用，進(jìn)一步證明了Cf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖具有抑制作用。

圖2　2　CfCf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性的影響Fig.2　Effect of Cf-LCB on the activity of LDH in the supernatant of 3T3-L1 preadipocytes

2.3Cf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

油紅O是一種脂溶性染料，可特異性地使細(xì)胞中的中性脂肪著色。油紅O染色結(jié)果顯示（圖3），從分化第0天開(kāi)始加樣，Cf-LCB能顯著地降低3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞數(shù)目及脂肪細(xì)胞中脂滴含量。半定量結(jié)果顯示，Cf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的平均抑制率為29.05%（P＜0.01）。

圖3　3　CfCf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響Fig.3　Effect of Cf-LCB on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

2.4Cf-LCB對(duì)已分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞TG含量的影響

圖4　4　CfCf-LCB對(duì)已分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積累的影響Fig.4　Effect of Cf-LCB on the lipid accumulation of differentiated 3T3-L1 adipocytes

如圖4所示，與對(duì)照組相比，Cf-LCB能顯著降低細(xì)胞中TG含量，且劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯，Cf-LCB劑量組TG含量平均降低20.44%（P＜0.01）。

2.5Cf-LCB對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因C/EBPα和PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

圖5　分化不同時(shí)期CCff--LLCCBB對(duì)　C/EEBBPPα、PPPPAARRγ mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5　Effect of Cf-LCB on mRNA expression of C/EBPα and PPARγ at different differentiation stages of 3T3-L1 preadipocytes

由圖5可知，隨著脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的進(jìn)行，C/EBPα和PPARγ的mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，且PPARγ mRNA的相對(duì)表達(dá)量在分化第4天時(shí)達(dá)到最大。經(jīng)Cf-LCB干預(yù)后，C/EBPα mRNA的相對(duì)表達(dá)量在第4天和第8天分別降低了35.34%和50.00%（P＜0.01）；PPARγ mRNA的相對(duì)表達(dá)量在第4天和第8天分別降低了53.18%和47.71%（P＜0.01）。

2.6Cf-LCB對(duì)WNT/β-catenin通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)量的影響

由圖6可知，隨著3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的進(jìn)行，WNT10b、FZ1、LRP6和β-catenin的mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。加入Cf-LCB干預(yù)后，F(xiàn)Z1、LRP6和β-catenin的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）。在分化的第4天，F(xiàn)Z1、LRP6和β-catenin的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別升高了39.00%、52.68%和56.98%，在分化的第8天，F(xiàn)Z1、LRP6和β-catenin的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別升高了25.80%、39%和137.11%。加入Cf-LCB干預(yù)后，WNT10b mRNA的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組無(wú)顯著性變化，均處于較低水平。

圖6　分化不同時(shí)期CCff-LCB對(duì)WWNNTT//β-catenin通路關(guān)鍵基因mRRNNAA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.6　Effect of Cf-LCB on mRNA expressions of the key factors for WNT/β-catenin pathway at different differentiation stages of 3T3-L1 preadipocytes

2.7Cf-LCB對(duì)WNT/β-catenin通路關(guān)鍵基因蛋白表達(dá)的影響

LRP6和β-catenin是WNT/β-catenin通路的重要組成部分，也是脂肪細(xì)胞分化的重要負(fù)調(diào)控因子。上述實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明在脂肪細(xì)胞分化第4天時(shí)，Cf-LCB增強(qiáng)WNT/ β-catenin通路的作用效果最佳。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Cf-LCB對(duì)WNT/β-catenin的影響，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了分化第4天時(shí)，100 μg/mL Cf-LCB對(duì)LRP6和β-catenin蛋白表達(dá)的影響。如圖7所示，Cf-LCB能顯著促進(jìn)LRP6和β-catenin蛋白表達(dá)（P＜0.01）。與對(duì)照組細(xì)胞相比，經(jīng)100 μg/mL Cf-LCB干預(yù)后，LRP6和β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別升高了286.84%和55.40%。WNT/β-catenin通路激活后，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中調(diào)控與脂肪細(xì)胞分化有關(guān)基因的表達(dá)。如圖7c所示，Cf-LCB能顯著促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的含量。100 μg/mL Cf-LCB作用后的細(xì)胞，其細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的含量比對(duì)照組增加了46.97%（P＜0.01）。

圖7　分化第4天　時(shí)CCff-LCB對(duì)WWNNTT//β-catenin通路關(guān)鍵基因蛋白表達(dá)的影響Fig.7　Effect of Cf-LCB on protein expression in WNT/β-catenin pathway at day 4 of differentiation

3　討 論

脂肪細(xì)胞在機(jī)體能量代謝及平衡中發(fā)揮著重要作用［1］。脂肪細(xì)胞分化是細(xì)胞數(shù)量增加、體積增大及TG累積的過(guò)程［12］。研究表明，脂肪細(xì)胞分化過(guò)程紊亂可能是誘發(fā)肥胖及其他代謝綜合征的一個(gè)重要原因［13］。本實(shí)驗(yàn)以3T3-L1前脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，考察了Cf-LCB對(duì)其分化的影響。結(jié)果表明，Cf-LCB能顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖，降低3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞數(shù)目及脂肪細(xì)胞中脂滴含量，減少TG在脂肪細(xì)胞內(nèi)的積累，提示其具有潛在的抗肥胖功效。

C/EBPα和PPARγ主要存在于脂肪細(xì)胞中，是脂肪細(xì)胞分化的兩個(gè)最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［14］。研究證明，在沒(méi)有任何外界激素的刺激下，C/EBPα的激活可以單獨(dú)誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的分化［15］。PPARγ是唯一被證明在脂肪細(xì)胞分化中必不可少的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，功能喪失實(shí)驗(yàn)證明PPARγ在脂肪細(xì)胞分化中是不可取代的［16］。本研究結(jié)果表明，Cf-LCB能顯著抑制C/EBPα和PPARγ的表達(dá)，證明其對(duì)脂肪細(xì)胞分化具有抑制作用。

WNT/β-catenin通路在細(xì)胞增殖及分化中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪組織中激活WNT/β-catenin通路，不僅會(huì)引起脂肪細(xì)胞分化受阻，甚至導(dǎo)致成熟脂肪細(xì)胞去分化［17］。WNT10b是參與WNT/β-catenin通路的主要WNT蛋白，WNT10b與前脂肪細(xì)胞細(xì)胞膜上的FZ受體及LRPs輔助受體結(jié)合可導(dǎo)致WNT/β-catenin通路被激活［18］。WNT10b在前脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，而隨著脂肪細(xì)胞分化的進(jìn)行，其表達(dá)量急劇降低，與脂肪含量成負(fù)相關(guān)［19］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此結(jié)論一致。FZ及LRPs對(duì)于WNT/ β-catenin通路也具有重要的調(diào)控作用［20］。研究表明，LRP6缺失型小鼠胚胎可以自發(fā)地誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化［21］。體外添加FZ的抑制劑可以在沒(méi)有任何外界刺激的情況下誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，Cf-LCB可以顯著增強(qiáng)FZ1和LRP6的表達(dá)，這提示Cf-LCB可能通過(guò)提高FZ1及LRP6的表達(dá)而激活WNT/β-catenin通路。WNT/β-catenin通路被激活后，細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin積累并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中［22］。作為WNT/β-catenin通路的關(guān)鍵因子，β-catenin的高表達(dá)對(duì)于抑制脂肪細(xì)胞分化具有重要作用［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，Cf-LCB增強(qiáng)了β-catenin的表達(dá)，并促進(jìn)其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，這提示Cf-LCB通過(guò)激活WNT/β-catenin通路抑制脂肪細(xì)胞分化。

綜上所述，Cf-LCB通過(guò)上調(diào)WNT/β-catenin通路中關(guān)鍵受體FZ1和LRP6的表達(dá)啟動(dòng)WNT/β-catenin通路，并通過(guò)提高β-catenin的表達(dá)及穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)β-catenin向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)錄活性，抑制C/EBPα和PPARγ的表達(dá)，進(jìn)而抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化。

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Suppressive Effect of Long-Chain Base from Sea Cucumber Cucumaria frondosa on the Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes and Underlying Mechanism

MAO Lei， XU Hui， TIAN Yingying， XU Jie， WANG Yuming， WANG Jingfeng*， XUE Changhu
（College of Food Science and Engineering， Ocean University of China， Qingdao266003， China）

The aim of the present study was to observe the effect of Cf-LCB on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes and to investigate the possible underlying mechanism. The effect of Cf-LCB on the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes was evaluated by MTT assay. After using differentiation cocktail to differentiate 3T3-L1 preadipocytes， the effect of Cf-LCB on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes was evaluated by oil red O-staining and determining TG content. mRNA expression levels of key genes associated with differentiation and WNT/β-catenin signal pathway in 3T3-L1 preadipocytes were measured by qRT-PCR. Expression levels of key prote ins in WNT/β-catenin signal pathway were measured by Western blotting. Results showed that Cf-LCB significantly inhibited the proliferation o f 3T3-L1 preadi pocytes， prevented the formation of lipid droplets in mature 3T3-L1 adipocytes and down-regulated C/EBPα and PPARγ. The mRNA expression of FZ1， LRP6 and β-catenin was distinctly enhanced by Cf-LCB， suggesting activation of WNT/β-catenin pathway. The increased protein expressions of key factors in WNT/β-catenin pathway including LRP6，total and nuclear β-catenin further demonstrated that Cf-LCB could markedly suppress the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes by activating WNT/β-catenin pathway.

Cucumaria frondosa； long-chain base； 3T3-L1 preadipocytes； adipogenesis； WNT/β-catenin signal pathway

R282.77

A

1002-6630（2015）23-0241-06

10.7506/spkx1002-6630-201523044

2015-06-25

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371876；31201329）

毛磊（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锘钚晕镔|(zhì)。E-mail：1164161817@qq.com

王靜鳳（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锘钚晕镔|(zhì)及分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：jfwang@ouc.edu.cn