粗壯脈紋孢菌降解豆皮粗纖維產(chǎn)可發(fā)酵糖培養(yǎng)基優(yōu)化及單糖分析

張　瑋，楊建遠，2，范亞葦，*，鄧澤元

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌　330047；2.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 九江　332000）

粗壯脈紋孢菌降解豆皮粗纖維產(chǎn)可發(fā)酵糖培養(yǎng)基優(yōu)化及單糖分析

張瑋1，楊建遠1，2，范亞葦1，*，鄧澤元1

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌330047；2.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 九江332000）

研究考察了粗壯脈紋孢菌固態(tài)發(fā)酵豆皮酒糟培養(yǎng)基產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)培養(yǎng)基組成，并用氣相色譜法對該發(fā)酵條件下豆皮纖維素降解所產(chǎn)的可發(fā)酵糖進行定性檢測。結(jié)果表明：產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為豆皮64%、酒糟34%、（NH4）2SO42%，在此培養(yǎng)基中粗壯脈紋孢菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的酶活力為2.83 IU/g，較優(yōu)化前的1.17 IU/g提高了141.88%，還原糖產(chǎn)量為18.01 g/100 g，較優(yōu)化前9.91 g/100 g提高了81.74%。獲得的可發(fā)酵糖的單糖組成主要為葡萄糖和木糖。

豆皮；粗壯脈紋孢菌；纖維素酶；可發(fā)酵糖；氣相色譜法

豆皮是大豆加工過程中的副產(chǎn)物，一般被用作動物飼料［1］，或者直接焚燒處理。不僅引起環(huán)境污染，而且造成生物質(zhì)資源的浪費和經(jīng)濟損失。以纖維素、半纖維素為原料生產(chǎn)的纖維乙醇，能有效地緩解糧食短缺、能源危機問題。含有豐富的纖維素和半纖維素的豆皮，是生產(chǎn)纖維乙醇的優(yōu)質(zhì)原料，然而，如何有效降解豆皮粗纖維一直是一個難題。

目前，降解木質(zhì)纖維素的方法有很多［2］，其中酶解法耗能低，處理條件溫和，無污染，是一種可持續(xù)發(fā)展的有效方法。但纖維素酶高昂的價格使得生產(chǎn)成本上升，成為乙醇發(fā)酵工業(yè)的限制因素。尋求一種既經(jīng)濟又高效的預(yù)處理方法，對于纖維乙醇的生產(chǎn)有重要的意義。

纖維素酶是一類能水解纖維素中β-1，4糖苷鍵，將纖維素降解成葡萄糖的酶系的總稱。一個高效完整的纖維素酶通常是由功能不同的三類葡萄糖苷酶組成，它們分別為：內(nèi)切葡聚糖酶（1，4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（1，4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1，4-β-D-glucannase，EC3.2.1.91）和β-葡聚糖苷酶（β-1，4-glucosidase，EC3.2.1.21）。3 種酶在協(xié)同作用下水解纖維素這一直鏈高聚物［3］。國內(nèi)外已有利用產(chǎn)纖維素酶的微生物降解纖維原料的報道［4-6］，但對比其他的處理方法（酸、堿處理法［7］）可發(fā)酵糖得率還不理想，瓶頸在于其纖維素酶的產(chǎn)率低［8］，纖維素酶系組成單一。

本實驗選用的粗壯脈紋孢菌，是由南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室自行篩選并誘變育種的一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株［9］。它不僅具有健全的纖維素酶系，而且在高纖維含量的培養(yǎng)基上生長旺盛。擬利用這一特性降解豆皮粗纖維，以期得到高產(chǎn)量的可發(fā)酵糖，為纖維乙醇的生產(chǎn)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。考慮到豆皮的營養(yǎng)成分不足，所以需要補充一些營養(yǎng)成分并對其進行優(yōu)化才能適合于粗壯脈紋孢菌生長和降解豆皮粗纖維。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與培養(yǎng)基

粗壯脈紋孢菌（Neurospora crassa），南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室自行篩選并保存。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；活化培養(yǎng)基：沙氏培養(yǎng)基。

1.1.2纖維原料

豆渣市售；豆皮、酒糟江西省茂昌實業(yè)有限公司。

1.1.3儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；HD-650超凈工作臺蘇州蘇杰凈化設(shè)備有限公司；HWS-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司；AR323CN電子天平奧豪斯儀器（上海）有限公司；HH-SⅡ恒溫水浴鍋鞏義市英峽華儀器廠；15R型高速冷凍離心機江西省立康科技公司；DFT-200粉碎機溫嶺市大德中藥器械有限公司；722紫外-可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；6890N氣相色譜儀美國Agilent公司；ALPHA2-4LSC真空冷凍干燥機德國Christ公司。

1.2方法

1.2.1孢子懸浮液的制備

在超凈工作臺上稱取1 g活化好的孢子加入裝有無菌水和玻璃珠的錐形瓶中（100 mL/250 mL），在搖床上充分振蕩30 min，用血球計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整濃度為108個/mL。

1.2.2培養(yǎng)條件

將1 mL孢子懸浮液接種在已滅菌的固體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫，70%恒濕培養(yǎng)3 d測定其纖維素酶活力。

1.2.3粗酶液的制備

將發(fā)酵后的培養(yǎng)基用玻璃研缽粉碎均勻后，稱取1 g固體發(fā)酵物，加入0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉（pH 5.2）緩沖液10 mL，180 r/min振蕩30 min。4 ℃離心10 min，取上清液即為粗酶提取液。

1.2.4酶活力測定

濾紙酶活力（filter paper activity，F(xiàn)PA）、內(nèi)切-β-葡聚糖酶（簡稱Cx酶）活力、外切-β-葡聚糖酶（簡稱C1酶）活力、β-葡萄糖苷酶（簡稱βG酶）活力的測定方法見參考文獻［10-13］。

酶活力單位定義：在50 ℃、pH 5.2條件下，1 mL粗酶提取液每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol產(chǎn)物的酶量定義為1 個酶活力單位，用IU/mL表示，換算成每克濕物料含有的酶活力，用IU/g表示。

1.2.5Plackett-Burman試驗設(shè)計

由于纖維素酶的調(diào)節(jié)因子ace2只受纖維素的影響［14］，所以真菌必須在含纖維素的培養(yǎng)基上才能代謝產(chǎn)纖維素酶。但是，不同纖維原料的纖維組成和結(jié)構(gòu)不同，所以誘導(dǎo)生產(chǎn)纖維素酶的活性差異較大［15］。根據(jù)研究前期的不斷摸索，本試驗在采用豆皮為主要原料的基礎(chǔ)上，再選擇豆渣和酒糟為補充碳源。選用試驗次數(shù)N=12的Plackett-Burman試驗設(shè)計，以酒糟、豆渣、（NH4）2SO4、KH2PO4、CaCl2、MgSO4這6 個因素為研究對象，另外選擇3 個虛擬項用于估計誤差，以每克濕物料含有的濾紙酶活力為響應(yīng)值，從中篩選出固體培養(yǎng)基中影響酶活力的主要影響因素。濾紙酶活力與產(chǎn)物中的還原糖產(chǎn)量表現(xiàn)出相似的變化趨勢，因此認(rèn)為濾紙酶活力可代表纖維素酶的總活力［16］。Plackett-Burman設(shè)計各因子水平見表1。

表1　Plackett-Burman試驗設(shè)計因素水平Table 1 Levels of variables chosen for Plackett-Burman design

1.2.6最陡爬坡試驗設(shè)計

最陡爬坡試驗將響應(yīng)值的變化和梯度方向作為爬坡方向，根據(jù)各因子的變化大小來判斷變化步長，快速、高效的逼近最佳值區(qū)域［17］。根據(jù)Plackett-Burman試驗數(shù)據(jù)分析，酒糟和（NH4）2SO4對纖維素酶的酶活力有顯著影響。

1.2.7中心組合試驗設(shè)計

篩選出影響粗壯脈紋孢菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的主要影響因子，并確定其最大響應(yīng)區(qū)域后，采用兩因素五水平的中心組合試驗（central composition design，CCD）對酒糟和（NH4）2SO4的添加量進一步優(yōu)化，以獲得該菌產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)基。中心組合試驗設(shè)計及水平取值見表2。

表2　中心組合試驗設(shè)計因素水平Table 2 Levels of variables chosen for central composition design

1.2.8還原糖含量測定

取1 g樣品，加入0.1 mol/L，pH 5.2的檸檬酸緩沖溶液10 mL，150 r/min振蕩提取30 min。離心，取上清液用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定還原糖的含量［18］。

式中：m1為水解液中還原糖的質(zhì)量/g；m2為纖維素水解理論上生成葡萄糖的質(zhì)量/g；37.77%為豆皮中粗纖維的含量。

1.2.9可發(fā)酵糖單糖組分測定

1.2.9.1粗糖提取液

稱取10 g培養(yǎng)物，加入200 mL蒸餾水，50 ℃水浴30 min，離心，取上清液。提取3 次。

1.2.9.2樣品除雜脫色

采用Sevag法脫蛋白，AB-8大孔樹脂脫色［19］。

1.2.9.3標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品的乙酰化［20］

準(zhǔn)確稱取10 mg葡萄糖、木糖標(biāo)準(zhǔn)品及其混合物。分別溶于10 mL超純水中，加入NaBH410 mg室溫下還原3 h，用乙酸中和過量的NaBH4，加入少量甲醇，減壓濃縮蒸干。然后加入10 mL醋酐，100 ℃條件下反應(yīng)1 h，加入少量甲苯，減壓濃縮蒸干。將乙酰化的產(chǎn)物用氯仿溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入少量超純水充分振蕩，除去上層水溶液，重復(fù)2～4 次，氯仿層用適量的無水硫酸鈉干燥，定容至10 mL，待氣相色譜（gas chromatography，GC）分析。

1.2.9.4菌液單糖的乙酰化

將經(jīng)過除蛋白、脫色后的單糖提取液冷凍干燥，準(zhǔn)確稱取10 mg樣品，加入10 mL超純水溶解。之后同1.2.9.3節(jié)中所述方法進行乙酰化操作。

1.2.9.5氣相色譜條件

色譜柱使用Agilent HP-5毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）［21］；檢測器：FID；載氣：N2；柱流速：0.6 mL/min，分流比：30∶1。進樣口溫度：280 ℃，檢測器溫度250 ℃。H2流速：40 mL/min，空氣流速：400 mL/min，尾吹N2流速：30 mL/min。進樣量：1 μL。

程序升溫：160 ℃保持2 min然后以10 ℃/min上升至240 ℃，保持20 min。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.05軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為顯著性水平。

2　結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman試驗篩選產(chǎn)酶培養(yǎng)基主要影響因素Plackett-Burman設(shè)計及試驗結(jié)果如表3所示。

表3　Plackett-Burman試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experiment design with response values

應(yīng)用Design-Expert 8.05對表3中的Y值進行回歸分析，所得Plackett-Burman回歸分析結(jié)果見表4。

表4　Plackett-Burman試驗結(jié)果方差分析Table 4　Regression analysis of the experimental results from Plackett-Burman design　ign

由表4可知，所有因素對FPA的影響均為正效應(yīng)，其中，酒糟添加量（P=0.009 4）、（NH4）2SO4添加量（P=0.002 2）在99%概率水平上差異顯著，由F值可以看出，酒糟和（NH4）2SO4添加量的F值分別為16.77、33.31。因此，選擇酒糟和（NH4）2SO4添加量進一步考察它們對FPA的影響。

2.2主要影響因素最陡爬坡試驗

表5　最陡爬坡試驗結(jié)果Table 5 Results of steepest ascent tests

由Plackett-Burman試驗結(jié)果可知，酒糟和（NH4）2SO4的添加量對FPA呈正效應(yīng)，即增加二者的添加量，F(xiàn)PA呈增長趨勢。所以應(yīng)適當(dāng)增加酒糟和（NH4）2SO4的添加量，提高發(fā)酵物中的FPA。由表5可知，隨著酒糟和（NH4）2SO4添加量的增加，F(xiàn)PA呈先增后減的趨勢，其中試驗組3中FPA最高，故以試驗組3的條件為響應(yīng)面試驗的中心點。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方

以最陡爬坡試驗得到的最佳試驗點為中心點，以FPA為響應(yīng)值設(shè)計中心組合試驗。試驗結(jié)果如表6所示。

表6　中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6　Central composite design with experimental results

根據(jù)試驗結(jié)果，運用軟件進行擬合和二次模型方差分析，得到響應(yīng)曲面二次多元回歸模型：

FPA=-4.113 07+30.767 34A+80.649 49B+ 800AB-60.75A2-8 975B2

對該模型進行方差分析，由表7方差分析可知，模型P=Prob＞F=0.000 1，表明該模型極顯著，失擬項P= Prob＞F=0.089 2不顯著，該模型的決定系數(shù)R2=0.984 7，說明該模型與實際情況的擬合程度好，可用于粗壯脈紋孢菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)基組分的分析和預(yù)測。

由表7的方差分析結(jié)果可知，酒糟和（NH4）2SO4的添加量對粗壯脈紋孢菌產(chǎn)纖維素酶的線性影響和曲面影響極其顯著，而二者的交互影響不顯著。這一結(jié)論也可從響應(yīng)面圖及等高線圖中直觀地反映出來。

表7　回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance of each term in regression equation

圖1 酒糟和（NHNH4）2SOSO4添加量對濾紙酶酶活力交互作用的響應(yīng)面（a）a和等高線圖（b）bFig.1　Response surface （a） and contour plots （b） for the effect of distillers’ grains and ammonia sulfate on cellulase activity

通過軟件計算，確定產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基的最佳組成為：豆皮64%、酒糟34%、（NH4）2SO42%。在此最優(yōu)條件下，纖維素酶活力為2.83 IU/g。

2.4驗證實驗

為驗證上述試驗結(jié)果，設(shè)計3 組平行實驗，按照最優(yōu)培養(yǎng)基：豆皮64%、酒糟34%、（NH4）2SO42%作為產(chǎn)纖維素酶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，在1.2.2節(jié)的條件下發(fā)酵，優(yōu)化后的纖維素產(chǎn)量達到2.83 IU/g，與理論值接近，因此，通過響應(yīng)面法優(yōu)化的培養(yǎng)基組分參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實踐參考價值。

2.5優(yōu)化前后的對比實驗

將優(yōu)化前的純豆皮發(fā)酵和優(yōu)化后的混合豆皮發(fā)酵產(chǎn)的纖維素酶活力及還原糖產(chǎn)量進行了比較。結(jié)果如表8所示。

表8　優(yōu)化前后纖維素酶活力和還原糖產(chǎn)量的比較Table 8　Comparison of cellulase activity and reducing sugar production before and after medium optimization

由表8可知，優(yōu)化后的培養(yǎng)基產(chǎn)纖維素酶的各組分酶活力都明顯優(yōu)于優(yōu)化前，且還原糖的產(chǎn)量也得到了顯著提高，這對于后續(xù)的乙醇發(fā)酵有重大的意義。

2.6可發(fā)酵糖單糖組分的研究

圖2　單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.2　GC chromatogram of mixed monosaccharide standards

圖3　可發(fā)酵糖的單糖組成氣相色譜圖Fig.3　GC chromatogram of monosaccharides in fermantable sugars

圖2為葡萄糖和木糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖，根據(jù)單標(biāo)的氣相色譜中標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間可知，1號峰為木糖，保留時間為6.455 min，2號峰為葡萄糖，保留時間為12.663 min，兩種單糖之間的分離效果好。圖3為豆皮降解產(chǎn)物中可發(fā)酵糖的單糖組成氣相色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間可知，1號峰為木糖，3號峰為葡萄糖。2號峰和4號峰物質(zhì)由于含量極低，缺乏研究意義，故在此不做討論。面積歸一法［22］可以通過總峰面積和單個峰面積計算出各單糖的百分含量，計算結(jié)果如表9所示。

表9　標(biāo)準(zhǔn)單糖與可發(fā)酵單糖組分氣相色譜分析結(jié)果Table 9 GC retention times and contents of monosaccharides

由表9可知，豆皮的降解產(chǎn)物中可發(fā)酵單糖主要由葡萄糖和木糖組成，其含量分別為56.03%和30.52%，葡萄糖的含量略高于木糖，這與稀酸水解的結(jié)果恰好相反［23］。在稀酸水解過程中，由于半纖維素結(jié)構(gòu)松散，所以更易被水解成木糖、阿拉伯糖等。而要達到水解纖維素的目的，只有升高溫度至120 ℃左右，才能水解少部分纖維素，葡萄糖得率低［24］。與稀酸水解不同，纖維素酶能定向水解纖維素產(chǎn)生葡萄糖［25］，所以水解產(chǎn)物中絕大部分的單糖均為葡萄糖，更有利于之后的乙醇發(fā)酵。而產(chǎn)物中的木糖可轉(zhuǎn)化為木糖醇［26］。

3　結(jié) 論

通過Plackett-Burman試驗確定豆皮、酒糟和（NH4）2SO4的添加量是纖維素酶活力的主要影響因子。通過最陡爬坡試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗確定最佳培養(yǎng)基配方為：豆皮64%、酒糟34%、（NH4）2SO42%。在此條件下，纖維素酶活力提高了141.88%，由最初的1.17 IU/g提高到2.83 IU/g。還原糖產(chǎn)量提高了81.74%，由最初的9.91 g/100 g提高到18.01 g/100 g。

在不少研究報道中，產(chǎn)酶培養(yǎng)基中一般需要添加一些參與菌體生長和物質(zhì)代謝所必需的礦質(zhì)元素和無機鹽，如磷酸鹽、Ca、Mg等。但本實驗研究發(fā)現(xiàn)，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基僅由豆皮、酒糟和（NH4）2SO4組成，就能完全滿足粗壯脈紋孢菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的營養(yǎng)需求。豆皮中含有豐富的礦物質(zhì)，如Ca（0.4%～0.66%）和P（0.11%～0.25%），但大多以植酸鹽及其絡(luò)合物的形式存在，礦質(zhì)元素以這種形式存在很難被微生物利用［27］。周小玲［28］發(fā)現(xiàn)，粗壯脈紋孢菌具有分泌植酸酶的功能，而植酸酶能催化植酸分解生成無機磷酸和肌酐，消除植酸與金屬離子或蛋白質(zhì)之間螯合或絡(luò)合作用，增加培養(yǎng)基中的可利用礦質(zhì)元素，提高有機磷和礦物質(zhì)的生物利用率。因此，在不添加礦物質(zhì)和無機鹽的固態(tài)培養(yǎng)基中，粗壯脈紋孢菌也能分泌產(chǎn)高活性的纖維素酶。

通過氣相色譜法分析了降解產(chǎn)物中可發(fā)酵單糖的組成，結(jié)果可發(fā)酵糖主要由葡萄糖和木糖組成，且葡萄糖產(chǎn)量更高，更有利于后續(xù)的乙醇發(fā)酵。而木糖同樣可以被轉(zhuǎn)化為木糖醇，作為乙醇發(fā)酵的副產(chǎn)品，增加生物質(zhì)能的經(jīng)濟價值。

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Optimization of Medium Composition for Soybean Hull Fiber Degradation by Neurospora crassa and Monosaccharide Composition Analysis of the Resulting Fermentable Sugars

ZHANG Wei1， YANG Jianyuan1，2， FAN Yawei1，*， DENG Zeyuan1
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang330047， China；2. College of Pharmaceutical and Life Sciences， Jiujiang University， Jiujiang332000， China）

In this work， Plackett-Burman design and response surface methodology were applied to optimize the solid medium containing soybean hull and distillers' grains to produce cellulase by Neurospora crassa. Meanwhile， the monosaccharide composition of fermentable sugars from the degraded product under optimal culture medium was analyzed by gas chromatography. The results showed that the optimal medium was composed of 64% soybean hull， 34% distillers' grains and 2% ammonia sulfate. Under the optimal condition， the activity of cellulase significantly was improved by 141.88%， from 1.17 IU/g to 2.83 IU/g， and the yield of reducing sugar was increasedby 81.74%， from 9.91 g/100 g to 18.01 g/100 g compared to that obtained with the unoptimized medium. The major monosaccharide components of the resulting fermentable sugars were glucose and xylose， respectively.

soybean hull； Neurospora crassa； cellulase； fermentable sugar； gas chromatography （GC）

S216

A

1002-6630（2015）23-0209-06

10.7506/spkx1002-6630-201523039

2015-01-26

江西省科技支撐計劃項目（20133BBF6002）

張瑋（1989—），女，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。E-mail：permanent_wei@163.com

范亞葦（1969—），女，副教授，博士，研究方向為微生物代謝。E-mail：fanyw6601@sina.com