響應面法優化樟芝固態發酵產安卓奎諾爾

路瑞秋，胡永丹，張薄博，許贛榮*

（江南大學生物工程學院，工業與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫　214122）

響應面法優化樟芝固態發酵產安卓奎諾爾

路瑞秋，胡永丹，張薄博，許贛榮*

（江南大學生物工程學院，工業與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

以樟芝菌固態發酵生產活性代謝產物安卓奎諾爾為目標物，采用Box-Behnken原理進行響應面分析，對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾條件進行優化，結果表明：接種量為296.80 mL/kg、Triton X-100添加量為1.10 mL/kg、輔酶Q0的添加量為0.23 g/kg時，理論上樟芝固態發酵培養基安卓奎諾爾產量的最大值為865.85 mg/kg。經驗證，安卓奎諾爾實際產量為865.32 mg/kg，表明實驗建立的模型能較好地預測實際發酵產安卓奎諾爾的情況。通過優化，樟芝固態發酵安卓奎諾爾產量比優化前（260.57 mg/kg）提高了232.09%。

樟芝；固態發酵；安卓奎諾爾；響應面

牛樟芝又名牛樟菇、血靈芝等，屬于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬、多年生蕈菌類，是1995年才確定的一個新種［1］。至2012年從牛樟芝中已分離得到的化合物約225 種，這些化合物包括大分子化合物蛋白、核酸、多糖等，小分子化合物木質素、芳香化合物、泛醌類［2］、馬來酸和琥珀酸衍生物［3］等。研究表明，樟芝的活性產物具有保肝護肝、抗癌、抗氧化、消炎等功效［4-7］。

樟芝僅生于臺灣深山特有的“國寶”級樹種——百年以上的牛樟樹上，且樟芝生長極為緩慢，形成子實體的時間相當長［8］，野生樟芝在市場上供不應求，每公斤野生樟芝子實體價格均在萬元以上，面對這種情況，通過人工培養的方法得到樟芝勢在必行。目前，樟芝的人工培養方法主要有3 種方式：椴木栽培法、液態培養法、固態培養法。而固態培養法以其得到的產物中活性成分與野生樟芝子實體活性成分的近似程度較高，且與培養子實體相比發酵周期較短，生產原料不受限制等優勢得到大范圍推廣。

2007年，Lee等［2］用正己烷萃取樟芝產物，得到一個新化合物安卓奎諾爾（antroquinonol），屬于泛醌類化合物。研究表明，安卓奎諾爾對胰腺癌、肝癌具有顯著的抑制作用［9-11］。Kumar等［12］研究顯示，安卓奎諾爾可以顯著地抑制3 種非小細胞型肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLS）癌細胞的增殖。目前已進入美國食品藥品管理局（U.S. Food and Drug Administration，FDA）二期實驗［13］，是具有優良前景的抗癌化合物。

目前，國內外學者關于安卓奎諾爾方面的研究多集中在其藥理活性等方面，對通過發酵條件的優化和代謝調控來提高樟芝菌發酵產安卓奎諾爾產量的報道極少，喻學淳等［14］對樟芝菌產安卓奎諾爾的固態發酵條件進行了優化，Hu Yongdan等［15］對樟芝菌液態發酵安卓奎諾爾的機理進行了研究。本研究主要通過對樟芝菌體的細胞通透性和代謝的調控［16-18］進行研究，以提高固態發酵安卓奎諾爾的產量，并利用響應面設計優化上述條件。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

樟芝菌上海福茂食品有限公司；谷物原料（粳米、秈米、糯米）市售。

NH4Cl、KH2PO4、MgSO4、無水乙醇均為國產分析純試劑；乙腈、甲醇（色譜純）德國Meker公司。

1.2儀器與設備

DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽上海?，攲嶒炘O備有限公司；PL602-S電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SPX-250B-Z型生化培養箱上海博迅實業有限公司醫療設備廠；高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）美國Waters公司；Sepax Amethyst C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，3 μm） 美國賽飛公司。

1.3方法

1.3.1培養基與培養條件

樟芝接種于PDA斜面，28 ℃避光培養9 d，于4 ℃保藏。

孢子懸浮液制備：取PDA斜面，加無菌水，并用接種棒將斜面表層孢子刮下，對孢子數進行鏡檢，孢子數達到1×106個/mL。

種子培養基：葡萄糖20 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、黃豆粉7 g/L。種子液在28 ℃、150 r/min條件下培養4 d。

固態發酵基礎培養基：谷物原料100 g、NH4Cl 0.04 g、KH2PO40.025 g、MgSO40.025 g，初始含水量 50 g水/g干基，接種量300 mL/kg干基，28 ℃培養24 d。

所有培養基均在115 ℃滅菌20 min。

1.3.2安卓奎諾爾的分析檢測方法

采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定樟芝產品中安卓奎諾爾產量。取樟芝固態發酵粉末3 g，加入無水乙醇75 mL，在35 ℃的DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽內振蕩提取85 min，靜置后0.22 μm微膜過濾，進行HPLC分析，具體分析條件如文獻［19］所示。

安卓奎諾爾參標由本實驗室自行制備［20-21］，經過紫外（ultraviolet，UV）、質譜（mass spectrometry，MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、HPLC分析，其純度≥91%。

1.3.3產品收率的測定

將固態發酵產物取出，45 ℃烘干至恒質量，稱質量并測定水分含量。產品收率按下式計算。

1.3.4樟芝固態發酵條件的研究

1.3.4.1谷物原料對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾影響的測定

分別稱取粳米、秈米、糯米各100 g放于1 L錐形瓶內，接入30 mL的種子液，于恒溫培養箱中28 ℃培養24 d后烘干磨粉測定安卓奎諾爾產量。根據安卓奎諾爾產量的大小確定最佳的發酵基質。

1.3.4.2接種量對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾的影響測定

將固態發酵基礎培養基（谷物原料為粳米）放于1 L茄子瓶中，分別接入100.00、200.00、300.00、400.00、500.00 mL/kg干基的種子液，于恒溫培養箱中28 ℃培養24 d后烘干磨粉測定安卓奎諾爾產量。根據安卓奎諾爾產量和收率的大小確定最佳的接種量。

1.3.4.3Triton X-100的添加對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾影響的測定

通過前期實驗證實添加表面活性劑Triton X-100［22-23］可以促進安卓奎諾爾的產生，將固態發酵基礎培養基（谷物原料為粳米）放于1 L茄子瓶中，接入200 mL/kg干基的種子液，發酵16 d進行28～25 ℃的變溫調控，發酵18 d分別添加Triton X-100 0.20、0.60、1.00、1.40 mL/kg，發酵30 d結束，烘干磨粉測定安卓奎諾爾產量。根據安卓奎諾爾產量和收率的大小確定Triton X-100的最適添加量。

1.3.4.4輔酶Q0的添加對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾影響的測定

通過前期實驗證實添加輔酶Q0可以促進安卓奎諾爾的產生，將固態發酵基礎培養基（谷物原料為粳米）放于1 L茄子瓶中，接入200 mL/kg干基的種子液，發酵16 d進行28～25 ℃的變溫調控，于發酵18 d分別添加Triton X-100 1.00 mL/kg，發酵20 d分別添加輔酶Q00.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/kg，發酵30 d結束，烘干磨粉測定安卓奎諾爾產量。根據安卓奎諾爾產量和收率的大小確定安卓奎諾爾的最適添加量。

1.3.5響應面試驗設計

綜合單因素試驗結果，應用Design-Expert 8.05軟件，采用Box-Behnken原理建立數學模型，以接種量（A）、Triton X-100添加量（B）、輔酶Q0添加量（C）為自變量，以安卓奎諾爾產量（Y）為因變量共設立了17 個處理組進行響應面試驗設計。

2　結果與分析

2.1樟芝固態發酵基本條件的研究

2.1.1谷物原料的篩選

圖1　不同谷物原料對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾的影響Fig.1　Effect of cereal substrates on antroquinonol production byA. camphorata in solid-state fermentation

固態發酵中，發酵基質作為菌體生長的附著物，為發酵提供主要的碳源及復雜的生長因子，影響著微生物的生長代謝，因此固態發酵基質的篩選對于產物的合成和積累有著非常重要的作用，大米作為樟芝固態發酵的基質有一定的優勢，但大米的種類較多，每種大米對樟芝發酵的影響不盡相同，因此本實驗考察了三類大米對樟芝菌生長和安卓奎諾爾合成的影響。如圖1所示，以三類大米為發酵基質進行樟芝固態發酵，發酵干基中安卓奎諾爾產量依次為：粳米＞秈米＞糯米。固態發酵的基質對樟芝次級代謝產物安卓奎諾爾的合成和積累有重要影響，樟芝菌可以在實驗所選取的谷物基質上生長，但是生長狀況有較大差異。粳米可以良好地支持樟芝菌生長，菌體生長較快，安卓奎諾爾積累量明顯高于其他兩類米；同樣的含水量下秈米比較干硬，樟芝菌生長較為緩慢，不利于安卓奎諾爾的合成和積累；糯米由于黏性較大，致使發酵基質的通氣性差，不利于樟芝菌體的生長，因此安卓奎諾爾的產量也較低。

2.1.2接種量對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾的影響

圖2　接種量對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾的影響Fig.2　Effect of inoculum amount on antroquinonol production byA. camphorata in solid-state fermentation

發酵過程中，接種量的大小影響發酵的產量和發酵周期［24］，接種量小時，菌體的延遲期延長，導致發酵周期延長，易染菌；接種量大時，由于接種的時候不僅帶入種子，還有培養液，而種子液中含有一些水解酶，有利于對基質的利用，可以縮短生長延遲期，減少污染機會，但接種量過高往往又會使菌體生長過快，菌體間競爭加大，反而會抑制后期代謝產物的產生，所以接種量的大小對樟芝固態發酵有著重要的影響。如圖2所示，隨著接種量的增加，安卓奎諾爾產量呈現先上升后下降的趨勢，產品收率呈現下降趨勢但下降不明顯，結合安卓奎諾爾產量和產品收率兩者來看選取接種量200.00 mL/kg作為樟芝固態發酵的最適接種量。

2.1.3Triton X-100添加量對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾的影響

發酵過程中，當胞內產物高濃度積累時可能會引起產物抑制阻礙活性產物產量的進一步提高，因此，考慮篩選合適的表面活性劑對樟芝細胞的通透性進行調節，希望可以進一步提高安卓奎諾爾產量的同時保持較高的產品收率。

表1　Triton X-100的添加量對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾的影響Table 1 Effect of Triton X-100 concentration on antroquinonolproduction by A. camphorata in solid-state fermentation

如表1所示，隨著Triton X-100添加量的增加，安卓奎諾爾產量呈現先增加后下降的趨勢，當Triton X-100的添加量為1.00 mL/kg時，安卓奎諾爾產量達到最高，為685.30 mg/kg。隨著Triton X-100添加量的增加，產品收率呈現上升趨勢，原因可能是Triton X-100的添加利于樟芝菌絲體生長的同時加速了安卓奎諾爾的分泌，從而實現了提高安卓奎諾爾產量的同時保持較高的產物的收率。

2.1.4輔酶Q0添加量對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾的影響

圖3　輔酶QQ0的添加對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾的影響Fig.3　Effect of coenzyme Q0concentration on antroquinonol production by A. camphorata in solid-state fermentation

微生物次級代謝產物的產量可以通過添加前體物質來促進合成［25-26］。但是目前有關安卓奎諾爾合成途徑方面的文獻極少，想要找到安卓奎諾爾合成的前體物質需從與安卓奎諾爾結構相似物的合成途徑中尋找，安卓奎諾爾屬于泛醌類化合物［25］，其分子結構式與輔酶Q10極為相似，而輔酶Q0是輔酶Q10的前體物質，因此實驗選擇輔酶Q0作為前體物研究其對安卓奎諾爾合成的影響。如圖3所示，添加輔酶Q0可以促進安卓奎諾爾的產生，隨著輔酶Q0添加量的增加，安卓奎諾爾產量呈現先上升后下降的趨勢，而產品的收率變化不明顯，當輔酶Q0的添加量達到0.20 g/kg時，安卓奎諾爾產量達到834.62 mg/kg，產品收率為39.5%，因此最后確定輔酶Q0的最適添加量為0.20 g/kg。

2.2響應面法分析

2.2.1響應面試驗結果

表2　Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental values of antroquinonol production

表3　回歸方程方差分析Table 3　Analysis of variance for the fitted regression equation with antroquinonol yield as a function n

由Box-Behnken原理設計方案所得的試驗結果見表2。選取接種量、Triton X-100添加量、輔酶Q0添加量為自變量，以安卓奎諾爾產量為應變量，通過Design-Expert軟件對試驗數據進行二次多項式回歸擬合，獲得樟芝固態發酵安卓奎諾爾產量對接種量、Triton X-100、輔酶Q0的二次多項式回歸方程為：Y=877.02+7.66A-6.56B+ 5.07C+10.96AB+14.00AC-3.97BC-22.83A2-30.02B2-31.71C2。

該二次項方程及各項方差分析如表3所示。模型F值為42.99，P＜0.000 1，說明模型高度顯著。此模型相關系數R2=0.982 2，表明回歸方程的擬合程度較好，預測值和實測值之間具有高度的相關性，可以應用于樟芝安卓奎諾爾產量的理論預測。由表3可知，二次項B2、C2對樟芝發酵安卓奎諾爾有高度顯著的影響（P＜0.000 1）；因素A、A2、AB、AC對樟芝發酵安卓奎諾爾影響極顯著（P＜0.01）；一次項B、C對樟芝發酵安卓奎諾爾有顯著影響（P＜0.05）；其他變量的影響均不顯著（P＞0.05）。表明模型中失擬項P＜0.000 1，說明由噪音引起模型偏差的概率P＜0.000 1，模型失擬項顯著。

2.2.2顯著影響因素的交互作用分析

圖4　各兩因素交互作用對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾的影響Fig.4　Response surface plots for the effects of culture conditions on antroquinonol production by A. camphorata

經Design-Expert軟件分析可得到3 個顯著影響因素之間的響應面分析圖，結果見圖4。響應面分析圖譜表示兩組獨立變量對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾的影響。由圖4可知，接種量和Triton X-100的交互影響及接種量和輔酶Q0的交互影響對樟芝發酵產安卓奎諾爾均有較顯著的影響。

2.3樟芝固態發酵產安卓奎諾爾最優培養基配方的獲取與驗證

對模型回歸方程進行進一步分析，得到的最優培養基組成為接種量296.80 mL/kg、Triton X-100添加量1.10 mL/kg、輔酶Q0添加量0.23 g/kg時，理論上樟芝固態發酵培養基安卓奎諾爾產量的最大值為865.85 mg/kg。由于以上最佳條件未包括在響應面優化的17 組試驗中，需進一步驗證。為了操作方便，將以上條件修正為接種量為300.00 mL/kg（干基）、Triton X-100添加量為1.00 mL/kg、輔酶Q0添加量為0.23 g/kg。驗證實驗結果表明，在最佳發酵條件為將固態發酵基礎培養基放于1 L茄子瓶中，接入20 mL的種子液，發酵16 d進行28～25 ℃的變溫調控，于發酵18 d分別添加Triton X-100 1.00 mL/kg，發酵20 d添加輔酶Q00.23 g，發酵30 d結束，樟芝發酵安卓奎諾爾的產量達到865.32 mg/kg，與預測值相差不大，說明該方程與實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性。

3　結 論

本實驗對樟芝固態發酵產安卓奎諾爾的培養基進行響應面優化。結果顯示，統計學優化策略能非常有效地優化調控樟芝固態發酵過程中活性代謝產物。接種量、Triton X-100和輔酶Q0添加量對安卓奎諾爾的產量影響顯著，在接種量為296.80 mL/kg、Triton X-100添加量為1.10 mL/kg、輔酶Q0的添加量為0.23 g/kg時，安卓奎諾爾產量的最大值為865.85 mg/kg。通過實驗驗證樟芝固態發酵安卓奎諾爾的產量為865.32 mg/kg，比優化前（260.57 mg/kg）的提高了232.09%。

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Optimization of Antroquinonol Production in Solid-State Fermentation of Antrodia camphorata Using Response Surface Methodology

LU Ruiqiu， HU Yongdan， ZHANG Bobo， XU Ganrong*
（Key Laboratory of Industry and Biotechnology， Ministry of Education， School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi214122， China）

In this study， response surface methodology based on Box-Behnken design was used to optimize the culture conditions for the production of the bioactive metabolite antroquinonol in solid-state fermentation of Antrodia camphorata. The optimal culture conditions were determined as inoculum amount of 296.80 mg/kg， Triton X-100 concentration of 1.10 mL/kg and coenzyme Q0concentration of 0.23 g/kg. Under these conditions， the maximum predicted yield of antroquinonol was 865.85 mg/kg， which was in good agreement with the experimental value of 865.32 mg/kg. Therefore， the established model could be used for predicting the culture conditions of Antrodia camphorate for antroquinonol production. After optimization， the yield of antroquinonol was increased 232.09% when compared with the control （260.57 mg/kg）.

Antrodia camphorate； solid-state fermentation； antroquinonol； response surface methodology

Q815

A

1002-6630（2015）23-0150-05

10.7506/spkx1002-6630-201523028

2014-12-23

國家自然科學基金青年科學基金項目（21306065）；江蘇省自然科學基金項目（BK20130134）

路瑞秋（1989—），女，碩士研究生，主要從事樟芝固態發酵研究。E-mail：luruiqiu2011@163.com

許贛榮（1954—），男，教授，博士，主要從事藥用真菌培養研究。E-mail：grxu123@126.com