超聲局部效應對咖啡酸穩定性及抗氧化性的影響

朱攀攀，馬亞琴*，竇華亭*，韓　智，李　申

（西南大學柑桔研究所，國家柑桔工程技術研究中心，重慶　400712）

超聲局部效應對咖啡酸穩定性及抗氧化性的影響

朱攀攀，馬亞琴*，竇華亭*，韓智，李申

（西南大學柑桔研究所，國家柑桔工程技術研究中心，重慶400712）

將超聲區域定位劃分成高低兩個超聲輻射面和5 個不同超聲位置（P1、P2、P3、P4、P5），對比研究低超聲輻射面與高超聲輻射面、超聲位置、提取溶劑對咖啡酸穩定性及其抗氧化性的影響。結果表明，低超聲輻射面能造成咖啡酸顯著降解（P＜0.05）；高超聲輻射面、超聲能量對咖啡酸穩定性的影響不顯著。溶劑類型是影響咖啡酸穩定性的主要因素之一，其中體積分數80%乙醇是咖啡酸理想的提取溶劑。超聲槽不同位置上，超聲能量的分布是不均一和動態變化的，咖啡酸在P4或P5位置時降解較為顯著（P＜0.05）。此外，超聲處理同樣能顯著影響咖啡酸的抗氧化性，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法、鐵離子還原力（ferric reducing antioxidant potential assay，FRAP）法及2，2'-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-amino-di）3-ethyl-benzothiazoline 6-sulphonic acid） ammonium salt，ABTS）法3 種方法測定的咖啡酸抗氧化性的變化規律存在一定差異性。DPPH法與FRAP法同時得到P5位置是影響咖啡酸抗氧化性最顯著的位置，該位置咖啡酸降解產物的抗氧化性高于咖啡酸自身的。不同超聲輻射面上，ABTS法測定咖啡酸的抗氧化性與其含量成正相關，而DPPH自由基清除能力與其含量成負相關。以上表明低超聲輻射面，有效的超聲能量能顯著影響咖啡酸的穩定性和增加其抗氧化性。

超聲輻射面；超聲波位置；咖啡酸；抗氧化

咖啡酸及其類似物廣泛存在于水果和蔬菜中，具有抗菌［1-2］、抗氧化［3］、抗腫瘤［4-5］等生物活性，其分子結構中含有兩個羥基、碳碳雙鍵及羧基，易發生聚合、氧化、加成等反應，是肉桂酸型酚酸中最易降解的一種單酸［6-7］。

近年來，超聲波技術己廣泛應用于各種天然活性物質的提取，與傳統的提取方法比較，具有低溫、快速、高效、環保等優勢。20世紀50年代，超聲波技術已在實驗室開始應用于增強提取效率的研究。隨后，超聲強化提取逐漸得到認可并開始迅猛發展。Paniwnyk等［8］從槐樹花芽中超聲強化提取蘆丁，發現不當的超聲處理導致提取量的下降。Ma Yaqin等［9］研究了利用超聲波輔助同時提取柑橘皮渣中的7 種酚酸，發現不同酚酸的超聲條件存在差別，超聲溫度對提取結果影響最顯著，超過40 ℃易造成咖啡酸降解。Khan等［10］同樣也利用超聲波輔助從柑橘皮渣中提取酚酸，并用中心組合試驗設計法對提取工藝進行了優化。Qiao Liping等［11］在模擬體系中研究了超聲處理對酚酸的影響，得出了溶劑和溫度是影響酚酸降解最重要的因素，酚酸的降解動力學符合零級動力學模型，其降解是因為發生了分解和聚合反應等。同時，Sun Yujing等［12］研究了超聲處理引起咖啡酸降解的機理，得出與Qiao Liping等［11］相似的結論，并用紅外光譜等方法分析了降解產物是其脫羧產物或二聚體。因此，不當的超聲處理易引起酚酸的降解，一方面是歸于酚酸自身結構的不穩定性及物理化學性質差異；另一方面，超聲場具有不均一性，整個超聲場中超聲能量是動態變化的，而超聲能量動態變化的定量檢測是目前研究的難點和熱點。Ma Yaqin等［13］利用超聲波從椪柑皮中提取橙皮苷發現，超聲能量對橙皮苷提取效率的影響不顯著。由于超聲能量存在特定的活性區域，并隨傳播距離的增加會發生吸收、散射或衰減。Romdhane等［14］同樣得到最高的超聲能量存在于超聲換能器附近且在超聲換能器直徑為6 cm輻射面以外能量急劇下降的結論。而局部超聲場中超聲參數對咖啡酸穩定性及抗氧化性的定位研究鮮有報道。

基于超聲能量隨傳播距離的增加而衰減的特性，及整個超聲場中超聲能量的不均一性，本研究將超聲槽從橫截面、縱截面、超聲位置［15］定位劃分，其超聲輻射面根據超聲活性區域存在于超聲換能器附近直徑為6 cm的范圍而確定［14，16］，6 cm的高度稱為低超聲輻射面，選擇高超聲輻射面（14 cm高度）與低輻射面作以比較。同時為簡化實驗，本研究在模擬體系中研究了超聲場區域處理對咖啡酸含量及抗氧化性的影響。通過超聲場中咖啡酸含量及抗氧化性的變化規律來分析超聲參數在不同超聲區域的特性，這有助于從根本上優化提取工藝和更有效發揮超聲波技術在食品加工中的作用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

甲醇、乙醇、冰乙酸（均為分析純）成都市科龍化工試劑廠；咖啡酸標準品（純度≥98%）北京百靈威科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，4，6-反式-2-吡啶基三嗪（1，3，5-tri（2-pyridyl）-2，4，6-triazine，TPTZ）、6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸（Trolox）、2，2'-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-amino-di （2-ethyl-benzothiazoline-6-sulphonic acid） ammonium salt，ABTS）、甲醇（色譜級）美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

DP-800超聲波清洗器上海生析超聲儀器有限公司；低溫恒溫槽寧波天恒儀器廠；FAZ004B電子分析天平上海精密儀器儀表有限公司；Ultimate3000高效液相色譜儀戴安中國有限公司；TTL-DCI氮吹儀北京同泰聯科技發展有限公司；TU-1901紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；移液槍大龍興創實驗儀器（北京）有限公司。

1.3方法

1.3.1超聲波處理

準確稱取2.5 mg咖啡酸標準品，用80%乙醇、100%甲醇兩種溶劑分別溶解定容至5 mL容量瓶中，并將以上母液分別稀釋至10 .g/mL。用移液槍準確移取8 mL樣液（超聲槽水位而定）至250 mL的錐形瓶中并用封口膜密封放于事先劃定的局部超聲槽中（低超聲輻射面（6 cm）處的P1、P2、P3、P4、P5；低超聲輻射面（14 cm）處的P1、P2、P3、P4、P5，圖1），連接低溫恒溫槽循環系統控制超聲槽溫度為25 ℃，25 kHz，800 W超聲處理60 min，重復3 次。

圖1　超聲波設備示意圖Fig.1　Schematic diagram of the ultrasonic apparatus

1.3.2咖啡酸含量的測定

1.3.2.1標準曲線的制作

采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定咖啡酸的含量。檢測條件：Thermo Fisher色譜柱（4.6 mm×250 mm ，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相：1%冰乙酸-純甲醇（75∶25，V/V）；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；波長：320 nm；外標法定量測定。

標準曲線的繪制：準確稱取2.5 mg的咖啡酸標準品，純甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶中作為母液，將以上母液稀釋至10 .g/mL，按5、10、15、20、30、40 .L的體積梯度進樣。以咖啡酸質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到咖啡酸的標準曲線為y=211.86x-0.330 9（R2=0.999 8）。

1.3.2.2HPLC測定

用移液槍準確移取1 mL超聲處理液置于氮吹儀上蒸發濃縮至干并用1 mL 50%的甲醇溶解，經0.45 .m濾膜后注入進樣瓶中待測備用。

1.3.3酚酸抗氧化性的測定

1.3.3.1DPPH自由基清除能力測定

純甲醇溶劑配制0.1 mmol/L DPPH溶液。移液槍移取50 .L樣品與1.95 mL DPPH溶液混合。同樣移取50 .L對應溶劑與1.95 mL DPPH溶液混合作空白對照，暗室靜置10 min后，采用TU-1901紫外分光光度計在517 nm波長處測其吸光度［17］。DPPH自由基清除率按以下公式計算。

1.3.3.2鐵離子還原力（ferric reducing antioxidant potential assay，FRAP）測定

0.1 mL樣品與2.45 mL FRAP溶液（0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ（溶于40 mmol/L HCl）、20 mmol/L FeCl3以體積比10∶1∶1配制）混合，另取0.1 mL對應溶劑與2.45 mL FRAP溶液混合均勻作空白對照，空白校零，暗反應30 min后，在593 nm波長處測定其最大吸光度［18］。用Trolox溶液制作標準曲線，鐵離子還原力用每克樣品的Trolox的當量表示。

1.3.3.3ABTS+·清除能力測定

將2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液和7 mmol/L的ABTS溶液按體積比0.5∶1混合，避光反應12～16 h。用無水乙醇稀釋ABTS溶液至吸光度為0.7±0.02。取3.9 mL ABTS溶液與0.1 mL樣品，另取3.9 mL ABTS溶液與0.1 mL 對應溶劑作空白對照，混合反應10 min后于734 nm波長處測其吸光度［19］。以Trolox當量表示抗氧化能力。

式中：A0為空白對照吸光度；At為樣品與ABTS溶液反應后的吸光度。

1.4數據分析

數據處理采用Excel和Origin 9.0分析軟件，用SPSS 20.0進行方差分析（ANOVA），數據結果表示為±s，P＜0.05為差異顯著。

2　結果與分析

2.1溶劑類型對咖啡酸穩定性的影響

表1　溶劑類型對咖啡酸穩定性的影響Table 1 Effect of solvent type on the stability of caffeic acid

由表1可知，同一超聲輻射面，溶劑類型對咖啡酸含量的影響較為顯著，咖啡酸在80%乙醇中的穩定性高于100%甲醇。一方面，超聲過程中溶劑分子的物理特性（包括表面張力、黏度、蒸汽壓等），可能影響咖啡酸的穩定性［20］，其中分子的蒸汽壓是影響溶劑物理特性的主要因素，溶劑的蒸汽壓又正比于其沸點，80%乙醇沸點較高，故咖啡酸在80%乙醇中不易降解；另一方面，不同溶劑分子的親和力不同［21］，80%乙醇溶劑分子中含有水分子氫鍵，使其親和力高于100%甲醇，咖啡酸在80%乙醇的穩定性較高。Zhang Qingan等［22］在研究超聲處理對沒食子酸穩定性的影響中得到沒食子酸在乙醇中的降解率最小。但Qiao Liping等［11］在模型實驗中研究超聲場對自由基酚酸超聲化學效應時，得到咖啡酸在80%乙醇中降解率較高，Sun Yujing等［12］在研究咖啡酸的降解動力學中也得出了咖啡酸在80%乙醇中具有最高的超聲化學效應，降解率較高，與本實驗結果存在一定差異性，需要進一步驗證。

由表1可知，不同超聲輻射面處理下溶劑對咖啡酸穩定性的影響差異顯著（P＜0.05）。與空白對照組相比，咖啡酸在100%甲醇-低超聲輻射面中與80%乙醇-高超聲輻射面中其質量濃度分別下降了8.67%和0.02%，降解較為顯著（P＜0.05）。這可能由于咖啡酸自身結構特點和超聲化學效應協同作用的結果。咖啡酸結構中有兩個羥基和碳碳雙鍵，是肉桂酸型酚酸最易降解的一種，在超聲場中易發生取代、加成等反應而出現降解［11］。因此，溶劑類型能顯著影響咖啡酸的穩定性，80%乙醇是咖啡酸理想的提取溶劑。

2.2超聲位置對咖啡酸穩定性的影響

圖2　局部超聲位置對咖啡酸穩定性的影響Fig.2　Effect of local ultrasonic position on the stability of caffeic acid

由圖2可知，局部超聲場中超聲能量是動態變化的。不同溶劑-超聲輻射面處理，咖啡酸質量濃度隨超聲槽位置的變化具有相似的變化規律，即從P1到P5，咖啡酸質量濃度先增加再減小，P5位置又出現上升趨勢，且均在P4位置出現一個極小值。原因在于超聲場中存在活性區域，高的超聲能量分布僅存在于活性區域的范圍，并隨超聲中心軸距離的增加，超聲活性區域隨之減弱，相關研究表明超聲槽中不同位置的超聲能量是不同的［15，23］。此外，咖啡酸的穩定性可能與超聲化學作用和提取溶劑的疊加效應有關。低超聲輻射面時，超聲能量較大，對應的超聲化學效應較強，P4位置咖啡酸質量濃度顯著降解，尤其是低超聲輻射面下降趨勢較顯著（P＜0.05），說明其對咖啡酸穩定性的影響可能大于溶劑類型的影響。同樣，溶劑類型可能與不同超聲槽位置上超聲能量存在交互作用，但需要進一步探討。以上可知，低超聲輻射面-P4可能是本實驗中超聲槽的活性區域，能顯著影響咖啡酸的穩定性。

2.3超聲輻射面處理對咖啡酸抗氧化性的影響

2.3.1DPPH自由基清除能力

圖3　局部超聲位置對DPPH自由基清除能力的影響Fig.3　Effect of local ultrasonic position on DPPH radical scavenging capacity

由圖3可知，空白對照組咖啡酸的DPPH自由基清除能力變化不明顯，在不同超聲槽位置處理咖啡酸，DPPH自由基清除率差異顯著（P＜0.05）。這是由于超聲場是一個能量不均一的區域，不同位置上的超聲效應也是動態的［15］。已有研究從芒果葉中超聲提取芒果苷并得到最大的提取率與超聲槽的位置有關［24］。不同超聲輻射面上，低超聲輻射面的DPPH自由基清除率整體比高超輻射面低（P5位置除外）。低超輻射面超聲能量較大，空穴效應較強，使易于降解的咖啡酸發生不同程度的由自由基介導的降解反應［11-12］，咖啡酸表現出較弱的抗氧化能力。P5位置咖啡酸雖顯著降解，但可能其降解產物的自由基清除率比咖啡酸本身強，整體表現出較強的DPPH自由基清除率。高超聲輻射面在P2位置DPPH自由基的清除率最大，P1、P5位置次之并無顯著性差異，且均比空白對照組的DPPH自由基清除率大。原因在于有效的超聲處理能提高提取物的抗氧化能力［25］。

2.3.2總還原力

圖4　局部超聲位置對FRAP值的影響Fig.4　Effect of local ultrasonic position on FRAP value

由圖4可知，低超聲輻射面上，80%乙醇為提取溶劑時，P5位置上咖啡酸的FRAP值較空白對照組提高了57.87%（P＜0.05）。這是由于有效的超聲處理提高了咖啡酸的抗氧化性。同一超聲輻射面，高超聲輻射面上，從P1到P5，80%乙醇為溶劑的咖啡酸的FRAP值高于100%甲醇的。而在低超聲輻射面上，則表現出相反的趨勢（除P4、P5外）。低超聲輻射面上，超聲場中的能量較高，具有較強的超聲效應，其對咖啡酸抗氧化性的影響占主導作用。這與Romdhane等［26］研究超聲裝置時得出離超聲中心軸3 cm時，超聲能量逐漸減小的結論相類似。高超聲輻射面上，提取溶劑是影響其抗氧化性的主要因素，80%乙醇有利于咖啡酸的溶出而表現出較強的抗氧化性。

2.3.3ABTS+·清除能力

由圖5可知，不同超聲位置上，ABTS+·清除率表現出不均一性。低超聲輻射面上，P4或P5上咖啡酸抗氧化能力最小，這是由于較強的超聲場效應使咖啡酸發生了降解（P＜0.05）。不同超聲輻射面，空白對照組的抗氧化性均高于超聲處理后的，超聲處理使不穩定的咖啡酸發生了降解，即咖啡酸的含量與其抗氧化性成正相關［27-29］。此外，超聲槽同一位置上，低超聲輻射面的咖啡酸抗氧化性均高于高超聲輻射面的抗氧化性，這與DPPH法得出的結論存在差異。這可能由于較強的超聲能量具有較強的空穴效應，顯著增加了咖啡酸降解體系中的抗氧化成分和提高降解產物的抗氧化性（P＜0.05）。同一超聲輻射面，低超聲輻射面上的100%甲醇咖啡酸的抗氧化性隨超聲位置的變化均比80%乙醇的高。這可能由于100%甲醇為溶劑的咖啡酸的降解產物具有更強的抗氧化性。咖啡酸降解體系中的抗氧化成分及其抗氧化性強弱需要進一步分析。

圖5　局部超聲位置對ABBTTSS+·清除率的影響Fig.5　Effect of local ultrasonic position on ABTS radical scavenging capacity

3　結 論

本研究結果表明，在低超聲輻射面處理咖啡酸比高超聲輻射面對咖啡酸穩定性和抗氧化性影響顯著。溶劑類型是影響超聲提取的重要因素，80%乙醇是提取咖啡酸的理想溶劑，而100%甲醇易造成咖啡酸的降解。咖啡酸含量隨超聲槽位置的不同而有所差異，其中P4或P5位置可能是本實驗超聲場中的活性區域。低超聲輻射面不同位置上的超聲空穴效應與溶劑類型之間存在的疊加作用也顯著影響咖啡酸的穩定性和其抗氧化性，這方面的研究有待于進一步的開展。利用3 種方法測定不同超聲輻射面處理對咖啡酸抗氧化性的影響，發現3 種方法得到的抗氧化值變化規律存在一定差異。DPPH法與FRAP法同時得到低超聲輻射面P5位置上咖啡酸降解產物具有更強的抗氧化能力。ABTS法得到咖啡酸的含量與其抗氧化性成正相關，不同超聲位置上，低超聲輻射面咖啡酸的抗氧化性高于高超聲輻射面的。綜上，整個超聲區域存在活性區域（低超聲輻射面（6 cm）-P4或P5），同時該區域能顯著影響咖啡酸等活性物質的穩定性和抗氧化性，這對設計專用超聲設備和從根本上優化提取工藝具有一定的參考價值。

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Effect of Local Ultrasound on Stability and Antioxidant Capacity of Caffeic Acid in a Model System

ZHU Panpan， MA Yaqin*， DOU Huating*， HAN Zhi， LI Shen
（National Citrus Engineering Research Center， Citrus Research Institute， Southwest University， Chongqing400712， China）

The space of ultrasonic bath was divided according to height and position into high and low ultrasonic irradiation surface each with five sections such as P1， P2， P3， P4 and P5. The effects of ultrasonic-assisted extraction parameters including solvent type and locally ultrasonic positions on the stability and antioxidant capacity of caffeic acid under different ultrasonic irradiation surfaces （at 6 cm and 14 cm high from the bottom） were comparatively analyzed in the present study. The results showed that caffeic acid was markedly degraded in low irradiation surface （P ＜ 0.05）. However， ultrasonic energy had no significant impact on the stability of caffeic acid in high irradiation surface. The type of solvent was one of the key factors in determining the stability of caffeic acid and 80% ethanol was the optimal solvent. In the meantime， the ultrasonic energy distribution was uneven and dynamic in the local positions， and the content of caffeic acid was decreased significantly in P4 or P5 of ultrasonic bath （P ＜ 0.05）. Moreover， the antioxidant activities of caffeic acid as determined by DPPH， FRAP and ABTS methods exhibited a big difference. Simultaneously， the position of P5 greatly affected antioxidant activity of caffeic acid evaluated by DPPH and FRAP methods， and of its degraded products had much higher antioxidant activity. Additionally， antioxidant capacity of caffeic acid as determined by ABTS method was positively correlated with its content， but DPPH free radical scavenging capacity had a negative correlation. These findings indicated that appropriate ultrasonic energy could change greatly the stability of caffeic acid and simultaneously enhance its antioxidant capacity in low irradiation surface.

ultrasonic irradiation surface； locally ultrasonic position； caffeic acid； antioxidant capacity

TS255.1；TS201.2

A

1002-6630（2015）23-0012-06

10.7506/spkx1002-6630-201523003

2015-05-22

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201459）；國家現代農業（柑橘）產業技術體系建設專項（CARS-27-05C）

朱攀攀（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養。E-mail：zpp2302090137@163.com

馬亞琴（1978—），女，副研究員，博士，研究方向為食品科學。E-mail：myaya211@163.com竇華亭（1961—），男，研究員，博士，研究方向為食品科學。E-mail：hdou33880@yahoo.com