嗜酸乳桿菌胞壁肽聚糖對(duì)小鼠腸黏膜的免疫調(diào)控

吳　振，潘道東，，*，郭宇星，曾小群，孫楊贏

（1.南京師范大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系，江蘇 南京 210097；2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

嗜酸乳桿菌胞壁肽聚糖對(duì)小鼠腸黏膜的免疫調(diào)控

吳振1，潘道東1，2，*，郭宇星1，曾小群2，孫楊贏2

（1.南京師范大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系，江蘇 南京 210097；2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

通過(guò)建立以致病性大腸桿菌感染小鼠為模型，研究氧化修飾前后嗜酸乳桿菌肽聚糖（peptidoglycan，PG）對(duì)小鼠腸道上皮細(xì)胞病理形態(tài)影響，及對(duì)感染大腸桿菌腸黏膜分泌sIgA、血清干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影響，發(fā)現(xiàn)灌胃PG后能夠促進(jìn)小腸黏膜分泌sIgA，降低IFN-γ及TNF-α的表達(dá)，且選擇性氧化修飾PG比未修飾PG具有優(yōu)勢(shì)?？梢姡人崛闂U菌在腸道免疫方面，可以通過(guò)其功能性PG提高對(duì)小腸黏膜的免疫調(diào)控作用。

嗜酸乳桿菌；肽聚糖；腸黏膜；免疫調(diào)控

黏膜作為機(jī)體的首要防御屏障，其主要功能是排斥和清除有害外源粒子，保護(hù)機(jī)體免受外源損傷［1］。隨著研究的深入，黏膜免疫保護(hù)機(jī)制的研究越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。在腸道中，誘導(dǎo)黏膜免疫的調(diào)控主要發(fā)生在腸道相關(guān)淋巴組織，特別是淋巴集結(jié)（peyer's patches，PP），以及在腸系膜內(nèi)存在的淋巴結(jié)［2］。有關(guān)研究表明，益生菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌能夠通過(guò)釋放細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10），抑制腸道致病菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附作用，保護(hù)腸道免受致病菌傷害［3-4］。

急性腸炎是盆腹腔腫瘤放療過(guò)程中最常見并發(fā)癥，以腹痛、腹瀉、里急后重、黏液血便為主要表現(xiàn)［5］。臨床中急性腸炎發(fā)病率高達(dá)50%～70%，不僅影響原發(fā)病的治療，而且可以引起腸道吸收不良，導(dǎo)致貧血、消瘦，嚴(yán)重者導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，多器官功能衰竭，甚至死亡［6-7］?！澳c道內(nèi)分泌功能障礙”是指腸道內(nèi)分泌功能不足或紊亂所導(dǎo)致的機(jī)體腸組織器官功能改變。這種情況下的腸道損傷，需要補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和水及電解質(zhì)來(lái)維持機(jī)體健康成長(zhǎng)［8］。小腸黏膜的組織結(jié)構(gòu)與其功能狀態(tài)有著密切聯(lián)系，腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化可以通過(guò)小腸絨毛高度、黏膜厚度及腸腺深度間接推測(cè)出腸道的病變情況［9］。乳酸桿菌等有益菌的代謝產(chǎn)物可以通過(guò)腸黏膜處的吞噬細(xì)胞進(jìn)入PP激活Th2細(xì)胞，從而產(chǎn)生大量的IL-10，而IL-10能夠進(jìn)一步促進(jìn)免疫球蛋白IgA因子的分泌。在Ig產(chǎn)生過(guò)程中，腸黏膜上皮細(xì)胞分泌物可以與IgA結(jié)合形成sIgA并排列在腸道黏膜上［10-11］。因此，當(dāng)sIgA與腸黏膜表面的益生菌共同存在時(shí)，就可以抑制致病菌在腸黏膜表面的黏附，進(jìn)而限制了有害菌的繁殖，對(duì)腸道菌群及腸黏膜功能的正常發(fā)揮都起到了很好的保護(hù)作用［12-13］。

乳酸菌細(xì)胞壁中肽聚糖的免疫學(xué)研究，目前主要集中在雙歧桿菌細(xì)胞壁肽聚糖方面，口服或非胃腸道途徑使肽聚糖進(jìn)入宿主體內(nèi)，可使宿主免疫監(jiān)視功能得到提高，并且促使免疫器官體內(nèi)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和抗體，同時(shí)提高巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞活性，達(dá)到提高機(jī)體特異與非特異免疫功能，從而發(fā)揮自身穩(wěn)定的細(xì)胞調(diào)節(jié)和抗感染的效果［14-15］。1-氧基-2，2，6，6，-四甲基哌啶（2，2，6，6-tetramethylpiiperidine-1-oxyl，TEMPO）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型穩(wěn)定的含氧自由基，它在自旋標(biāo)記法及理論上被廣泛應(yīng)用，目前已成為自由基化學(xué)主要發(fā)展方向之一［16］。TEMPO與NaClO/NaBr構(gòu)成一種新型催化氧化體系，此體系具有高度選擇性氧化功能，將糖類物質(zhì)中的伯羥基氧化成相應(yīng)的羧酸鹽，從而賦予了糖類物質(zhì)一些特殊的性能，如溶解性；而對(duì)來(lái)源于嗜酸乳桿菌肽聚糖的氧化修飾未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立以致病性大腸桿菌（Escherichia coli 0111：B4）感染小鼠為模型，研究選擇性氧化修飾前后嗜酸乳桿菌肽聚糖（peptidoglycan，PG）對(duì)小鼠腸道上皮細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)及PG對(duì)感染大腸桿菌腸黏膜分泌sIgA、血清干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）細(xì)胞因子的影響，探討PG對(duì)感染致病性大腸桿菌小鼠腸黏膜的免疫調(diào)節(jié)作用。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑與儀器

健康成年雄性ICR小鼠（動(dòng)物合格許可證編號(hào)：批號(hào)SCXK（HU）2012-0002），平均體質(zhì)量（20±2）g，由寧波大學(xué)動(dòng)物中心提供。

sIgA、IFN-γ、TNF-α ELISA試劑盒 南京建成生物工程公司；PG由本實(shí)驗(yàn)室從嗜酸乳桿菌中提取，氧化PG由TEMPO/NaClO/NaBr選擇性氧化，保存于-20 ℃?zhèn)溆?；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、RIPA強(qiáng)蛋白裂解液 江蘇碧云天生物試劑公司。

Thermo MK3全波長(zhǎng)掃描多功能酶標(biāo)儀 熱電（上海）儀器有限公司；DW-86L490型超低溫保存箱青島海爾特種電器有限公司；W H-3微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；低速冷凍離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）儀 北京六一儀器廠。

1.2方法

1.2.1分組與造模

ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、感染組（E. coli 0111：B4感染組）、PG治療組（高劑量0.5 mg/g，中劑量0.25 mg/g，低劑量0.125 mg/g）及氧化PG治療組（高劑量0.5 mg/g，中劑量0.25 mg/g，低劑量0.125 mg/g）；每組7 只，共計(jì)8 組。飼養(yǎng)5 d后，對(duì)照組每只灌服生理鹽水0.2 mL；感染組每只用改良的注射器灌胃0.2 mL E. coli 0111：B4菌液（1×109CFU/mL），次日起每天灌服肽聚糖溶液0.2 mL，連續(xù)5 d；治療組第5天灌服0.2 mL E. coli 0111：B4菌液（1×109CFU/mL），1 h后，灌服肽聚糖溶液0.2 mL，次日起每天灌服肽聚糖溶液0.2 mL，連續(xù)5 d。末次灌胃后12 h處死動(dòng)物，采集組織樣本［17］。

1.2.2腸黏膜形態(tài)學(xué)觀察

取ICR小鼠2～3 cm回腸組織，迅速用新配制的生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的明膠溶液包埋，放入液氮中冰凍切片，染色，顯微鏡下觀察組織學(xué)變化（放大倍數(shù)為×100），圖像分析儀隨機(jī)全盲測(cè)量腸絨毛高度，隱窩深度及黏膜厚度［18］。

1.2.3小腸相關(guān)蛋白SDS-PAGE分析

取不同處理組相同部位的小腸組織1 g，迅速用無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液沖洗腸內(nèi)容物，之后用無(wú)菌手術(shù)剪剪碎組織，并用蛋白裂解液進(jìn)行裂解處理（4 ℃，30 min）。收取裂解液，12 000 r/min離心15 min，回收上清液，經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定，統(tǒng)一各組的蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL。之后蛋白樣品加入緩沖液后水浴5 min。處理好的蛋白樣本放入-20 ℃冰箱備用［19］。

1.2.4細(xì)胞因子檢測(cè)

取ICR小鼠回腸末端5 cm，平鋪于濾紙上，縱行剪開，無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)沖洗腸腔表面后，刮下黏膜，研磨成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的勻漿，4 000 r/min、4 ℃離心15 min，取0.2 mL上清液至-80 ℃冰箱待檢。取上清液及標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL置于96 孔板中，37 ℃溫育30 min，甩干液體，洗滌液進(jìn)行反復(fù)洗滌5 次后，加入酶標(biāo)耦合液100 μL，37 ℃條件下溫育30 min后，甩干液體，洗滌液進(jìn)行反復(fù)沖洗5 次，每孔加入底物A、B液各50 μL，37 ℃條件下反應(yīng)15 min，之后加入終止液50 μL，于450 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定sIgA、IFN-γ和TNF-α含量。以上實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果與分析

2.1小腸形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)小鼠灌服大腸桿菌后均有不同程度的腹瀉。感染組小鼠精神萎靡、飲食活動(dòng)量減少、嗜睡、對(duì)外界反應(yīng)遲鈍，其中有3 只小鼠出現(xiàn)死亡；而PG及氧化PG治療組均未出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象。光鏡觀察結(jié)果如圖1所示：感染組小鼠絨毛水腫，部分小鼠絨毛上皮細(xì)胞脫落，絨毛高度和隱窩深度降低。PG治療組（高劑量0.5 mg/g）及氧化PG治療組（高劑量0.5 mg/g）小腸絨毛均完整，水腫較輕，絨毛高度和隱窩深度較大。

圖1　不同處理下的小腸黏膜形態(tài)Fig.1　Morphology of intestinal mucosa in mice observed under different treatment conditions

感染組小腸絨毛高度、隱窩深度及黏膜厚度均低于對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）。感染組和治療組均高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明PG能夠提高小鼠腸絨毛高度、隱窩深度及黏膜厚度。感染組與治療組之間沒有顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明感染組與治療組療效相當(dāng)；而修飾前后PG治療組與感染組沒有顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明選擇性氧化修飾前后PG對(duì)預(yù)防與治療大腸桿菌感染腸黏膜療效沒有差異，結(jié)果如表1所示。由于氧化修飾后PG的提高了PG的溶解性，因此，PG的選擇性氧化修飾對(duì)于PG的溶解性能改良是一種很好的方式。

表1　各組小腸組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)的比較Table1　Comparison of intestinal morphology in different groups

2.2氧化修飾PG對(duì)小腸相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

根據(jù)對(duì)照組、感染組及氧化PG治療組的SDS-PAGE分析，通過(guò)上樣同等濃度的蛋白樣本（5 μg），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在70 kD和45 kD的分子質(zhì)量區(qū)域，治療組與感染組的部分蛋白表達(dá)存在差異，而且這種差異與氧化PG的劑量存在依賴性。由此可見，氧化PG對(duì)于小腸黏膜的免疫調(diào)控作用是存在的，而且這種調(diào)控作用可能與NF-κB通路蛋白相關(guān)［20］。

圖2　不同條件下小腸蛋白變化的SDS-PAGE分析Fig.2　Changes in total protein abundance in mouse small intestine after different treatments

2.3氧化修飾前后PG對(duì)腸黏膜分泌細(xì)胞因子的影響

2.3.1不同濃度肽聚糖對(duì)小鼠腸黏膜分泌sIgA的影響

sIgA是腸黏膜上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的小體IgA與雙體IgA分子結(jié)合形成，能降低腸道蛋白酶的分解，從而形成黏膜上的抗體。由于多糖含有其他菌群的共同抗原，因此sIgA能與腸道內(nèi)有害物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，阻止這些物質(zhì)在腸道上皮的黏附和穿透，中和毒素、緩解腹瀉、胃炎及過(guò)敏反應(yīng)等癥狀［21］。由圖3可知：低劑量肽聚糖與感染組相比沒有明顯差異；原PG與氧化后PG都能夠促進(jìn)黏膜分泌sIgA（0.01＜P＜0.05），且PG灌胃濃度越高，分泌sIgA因子越多；氧化后PG促進(jìn)分泌sIgA的能力優(yōu)于原PG，與感染組之間存在極顯著差異（P＜0.01）。通過(guò)灌胃PG及氧化PG，都能很好的降低E. coli 0111：B4引起的腸道炎癥反應(yīng)，而且PG氧化后沒有對(duì)其功能產(chǎn)生影響，且氧化PG對(duì)sIgA分泌的促進(jìn)作用更加明顯?？梢奝G可以通過(guò)促進(jìn)sIgA的生成來(lái)提高腸道的抗炎調(diào)節(jié)作用。

圖3　PG及氧化PG對(duì)小鼠腸黏膜組織sIgA的影響Fig.3　Effect of PG and oxidized PG on the release of sIgA in mouse intestinal mucosa

2.3.2不同肽聚糖對(duì)小鼠腸黏膜分泌IFN-γ的影響

在生物體內(nèi)，IFN-γ調(diào)控一系列的生化過(guò)程，發(fā)揮著抗菌、抗癌以及相關(guān)免疫調(diào)節(jié)活性。IFN-γ的這些生物活性發(fā)揮依賴于胞內(nèi)信號(hào)途徑參與的基因調(diào)控［22］。由圖4可知：感染組與低劑量組比較，IFN-γ含量無(wú)顯著變化；中劑量組與高劑量組相對(duì)感染組，IFN-γ含量顯著下降（P＜0.05）；感染大腸桿菌后，小腸黏膜層細(xì)胞釋放IFN-γ細(xì)胞因子的含量升高；但隨著PG給藥濃度的升高，IFN-γ含量逐漸減低，且氧化PG治療組的效果更加顯著。表明氧化修飾對(duì)于PG功能的發(fā)揮具有很好的促進(jìn)作用。

圖4　PG及氧化PG對(duì)小鼠腸黏膜組織IFN--γ的影響Fig.4　Effect of PG and oxidized PG on the release of IFN-γ in mouse intestinal mucosa

2.3.3不同濃度肽聚糖對(duì)小鼠腸黏膜分泌TNF-α的影響

大腸桿菌感染誘發(fā)腸黏膜巨噬細(xì)胞等分泌TNF-α，啟動(dòng)腸道內(nèi)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致黏膜脫落、壞死，腸道機(jī)械屏障功能受損［23］。由圖5可知，與感染組比較，低劑量組中TNF-α含量變化不大，無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。中劑量組與高劑量組相對(duì)感染組，TNF-α含量顯著下降（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃E. coli 0111：B4后，腸道細(xì)胞內(nèi)TNF-α含量升高，但隨著PG的濃度梯度治療作用，TNF-α含量逐漸降低。TNF-α作為重要的炎癥釋放因子，對(duì)于炎癥的產(chǎn)生，具有重要作用，它可以介導(dǎo)響應(yīng)NF-κB信號(hào)途徑，激活一系列的炎癥因子釋放［24］。本實(shí)驗(yàn)中的氧化PG，作為炎癥因子的抑制劑，對(duì)于E. coli 0111：B4介導(dǎo)的小鼠腸黏膜炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制作用，為研究嗜酸乳桿菌對(duì)腸道菌群平衡的免疫調(diào)節(jié)活性提供了良好的理論依據(jù)。

圖5　PG及氧化PG對(duì)小鼠腸黏膜組織 TNF-α的影響Fig.5　Effect of PG and oxidized PG on the release of TNF-α in mouse intestinal mucosa

3　結(jié) 論

在嗜酸乳桿菌胞壁肽聚糖對(duì)小鼠腸黏膜的免疫調(diào)控中，相比E. coli 0111：B4感染的小腸絨毛水腫，部分小鼠絨毛上皮細(xì)胞脫落， 絨毛高度和隱窩深度降低。PG及氧化PG能夠保持小腸絨毛均完整，降低大腸桿菌感染引起的水腫，絨毛高度和隱窩深度也較感染組深。在小腸黏膜免疫因子的檢測(cè)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧化后PG促進(jìn)分泌sIgA的能力優(yōu)于原PG，與對(duì)照組之間存在極顯著差異（P＜0.01）。灌胃PG后能夠降低IFN-γ及TNF-α的表達(dá)，且選擇性氧化修飾后PG在抑制腸炎反應(yīng)較PG具有優(yōu)勢(shì)；氧化PG不僅提高了PG的溶解度，同時(shí)高劑量組的氧化修飾PG可以顯著降低IFN-γ及TNF-α的釋放。

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Immunoregulatory Activity of Lactobacillus acidophilus Peptidoglycan in Mouse Intestinal Mucosa

WU Zhen1， PAN Daodong1，2，*， GUO Yuxing1， ZENG Xiaoqun2， SUN Yangying2
（1. Department of Food Science and Nutrition， Nanjing Normal University， Nanjing 210097， China；2. School of Marine Science， Ningbo University， Ningbo 315211， China）

As an important immune system， mucosal immune system is the first line to protect the mucous membranes against colonization and invasion by potentially dangerous microbes that may be encountered. In this study， the immunoregulatory activity of Lactobacillus acidophilus peptidoglycan （PG） was investigated on pathogenic Escherichia coli（E. coli）-induced mouse model. Compared with PG， the oxidative modification of PG had a significant effect on the secretion of sIgA， reduced the expression of interferon-γ （IFN-γ） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in the intestinal mucosa. PG derived from Lactobacillus acidophilus had the capability of enhancing immune regulation of intestinal mucosa.

Lactobacillus acidophilus； peptidoglycan； intestinal mucosa； immunoregulatory activity

TS201.3

A

1002-6630（2015）13-0207-04

10.7506/spkx1002-6630-201513038

2014-12-26

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（41276121；31471598）；江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（BK20141447）；浙江省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（Q16C200005）

吳振（1985—），男，博士研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：woodsen@163.com

潘道東（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：daodongpan@163.com