響應面法優化酶法制備杏鮑菇蛋白及其營養評價

張夢甜，楊文建，裴　斐，趙立艷，安辛欣，馬　寧，程　薇，胡秋輝，*

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023； 2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；3.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064）

響應面法優化酶法制備杏鮑菇蛋白及其營養評價

張夢甜1，楊文建1，裴斐1，趙立艷2，安辛欣2，馬寧1，程薇3，胡秋輝1，*

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023； 2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；3.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064）

為確定纖維素酶法提取杏鮑菇蛋白的最佳工藝，并評價所得蛋白的營養價值，在單因素試驗的基礎上，選擇液料比、加酶量（以原料干粉計）、pH值和酶作用溫度為影響因素，以蛋白得率為響應指標，利用Box-Behnken進行響應面分析，利用氨基酸系數法來評價杏鮑菇蛋白的營養價值。結果表明：杏鮑菇蛋白提取的最佳工藝為：液料比35∶1（V/m）、加酶量2.6%、pH 7.2、酶解溫度60 ℃，此條件下的杏鮑菇蛋白得率達10.68%；按此方法所得的杏鮑菇蛋白的必需氨基酸與非必需氨基酸比值（essential amino acids/nonessentia amino acids，EAA/NEAA）為0.65，必需氨基酸與總氨基酸比值（EAA/total amino acids，TAA）為0.40，氨基酸比值系數分（score of ratio coeffi cient，SRC）為75.02。該工藝操作簡單，所得蛋白品質較高，可用于工業生產杏鮑菇蛋白產品。

杏鮑菇；蛋白；響應面法；氨基酸組成

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側耳，隸屬真菌門、擔子菌綱、傘菌目、側耳科、側耳屬，被譽為“菇中之王”［1］。杏鮑菇蛋白含量豐富，是常規蔬菜的 3～6 倍［2］，有研究表明，杏鮑菇蛋白具有較高的生物活性，Mariga等［3］進行了杏鮑菇蛋白對多種腫瘤細胞增殖抑制作用及免疫細胞生長影響作用等體外實驗，結果表明杏鮑菇蛋白具有良好的抗氧化、抗腫瘤及免疫調節活性，因此杏鮑菇蛋白具有良好的產品開發潛質。目前關于杏鮑菇功能物質提取工藝的相關研究主要集中于多糖［4-5］，杏鮑菇蛋白高效制備工藝與產品開發的研究未見報道。

目前蛋白的提取方法大都為 傳統的堿溶酸沉法［6］、鹽溶法［7］、酶法［8］、超聲波輔助法［9］等。其中酶法提取所需反應條件溫和，不僅保持了蛋白質的營養價值和功能性質［10-12］，而且顯著降低了反應成本。對于食用菌而言，真菌細胞的細胞壁使細胞保持一定的形狀，其主要成分是幾丁質、纖維素等己糖或氨基己糖構成的多糖鏈［13］，其中杏鮑菇中纖維素含量達12.74%［14］，故可通過水解纖維素破壁釋放蛋白，促進蛋白溶解的原理來提取杏鮑菇蛋白。

本實驗主要研究纖維素酶法優化杏鮑菇蛋白的提取工藝，并進行了杏鮑菇蛋白的氨基酸組成分析，得到具有較高營養價值的杏鮑菇蛋白制品，為工業制備杏鮑菇蛋白制品提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮杏鮑菇（Pleurotus eryngii）由江蘇天豐生物科技有限公司提供。

纖維素酶（酶活力≥1.5×104U/g） 國藥集團化學試劑有限公司；2，2'-聯喹啉-4，4'-二甲酸二鈉（butyleyanoacrylate，BCA）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

1.2儀器與設備

FW高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；Allegra系列冷凍離心機 美國Beckman Coulter有限公司；RE52CS旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；伯樂i-mark酶標儀 美國Bio-Rad公司；MD31透析袋 美國Spectrum公司；L-8900高速氨基酸分析儀 日立高新技術公司；Barnstead GenPure xCAD超純水儀 南京微弗德科學儀器有限；BUCHI小型噴霧干燥儀 上海萬捷科技有限公司。

1.3方法

1.3.1原料預處理

新鮮杏鮑菇經清洗、切片放于烘箱中50 ℃鼓風烘干，超微粉碎機粉碎，過100 目篩，置于4 ℃條件下備用。

1.3.2蛋白質含量測定方法

采用BCA法［15］，以牛血清白蛋白為標準蛋白，BCA工作液染色。按公式（1）計算杏鮑菇蛋白得率。

式中：Y為杏鮑菇蛋白得率/%；ρ為蛋白提取液質量濃度/（mg/mL）；V為蛋白提取液體積/mL；m為杏鮑菇干粉質量/mg。

1.3.3杏鮑菇蛋白提取方法

1.3.3.1酶法提取杏鮑菇蛋白

稱取一定量杏鮑菇粉，按一定液料比加蒸餾水并調節pH值，加入一定比例纖維素酶（以原料干粉計）并充分攪拌，在一定溫度下恒溫振蕩反應4 h，反應完成后放入80 ℃水浴10 min鈍化酶，取出放置至常溫后13 000×g離心20 min。收集上清液，取沉淀重復上述步驟再次提取，合并兩次所得的上清液，測定總蛋白含量。將上清液直接噴霧干燥得到杏鮑菇粗蛋白（Pleurotus eryngii crude protein，PECP）。將所得上清液調pH值至5.0放置30 min，再4 000×g離心20 min，取沉淀透析，真空冷凍干燥得到杏鮑菇純化蛋白（Pleurotus eryngii purified protein，PEPP）。

1.3.3.2水提法提取杏鮑菇蛋白

取5 g杏鮑菇干粉，按比例加入蒸餾水，充分攪拌后置于恒溫振蕩器中反應4 h，離心取上清，沉淀再次提取，合并上清液，測蛋白含量。

1.3.4酶法提取杏鮑菇蛋白工藝的確定

1.3.4.1單因素試驗

分別考察液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（V/m），pH值（5、6、7、8、9），纖維素酶添加量（以原料干粉質量計）（0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%），反應溫度（30、40、50、60、70 ℃）。考察單一因素時，其余條件固定為：液料比30∶1、pH 7、纖維素酶添加量2.5%、反應溫度60 ℃。

1.3.4.2響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇液料比、加酶量、酶作用pH值、酶作用溫度為關鍵工藝參數，進行四因素三水平Box-Behnken試驗設計。以杏鮑菇蛋白得率作為響應值，利用Design-Expert 8.0.6 軟件對數據進行分析，得出最佳的纖維素酶法提取杏鮑菇蛋白工藝條件。

1.3.5氨基酸組成分析及氨基酸比值系數法評價杏鮑菇蛋白的營養價值

參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。準確稱取一定量樣品于水解管中，加入適量6 mol/L HCl，在減壓下密封水解管，將其放入烘箱，在110 ℃條件下水解24 h。將水解后的樣品過濾后放入圓底燒瓶，旋轉蒸發去除鹽酸。所得樣品用0.02 mol/L HCl定容至50 mL，吸取少量水解液經0.22 μm濾膜過濾，裝入進樣瓶中待測。

氨基酸比值系數法是根據氨基酸平衡理論，并結合聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，FAO/WHO）的必需氨基酸模式，分別用公式（2）、（3）和（4）計算樣品中必需氨基酸的包括氨基酸比值（ratio of amino acids，RAA）、氨基酸比值系數（ratio coefficient，RC）和氨基酸比值系數分（score of ratio coeffi cient，SRC）3 個指標，來評價蛋白質的營養價值。

式中：C1為評價蛋白質中的必需氨基酸含量/（mg/g pro）；C2模式中對應的必需氨基酸含量/（mg/g pro）分別為RAA、RC的平均值；n為WHO/FAO必需氨基酸參考模式中計算所得RC的個數。

1.4數據處理

杏鮑菇蛋白提取優化響應面試驗采用Design-Expert 8.0.6軟件處理，數據以3 次獨立樣品測定結果的±s表示，并進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），用SPSS 18.0軟件進行顯著性分析，檢驗水平α為0.05。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

由大量文獻資料［17-20］可知，影響酶法提取蛋白的主要影響因素有液料比、加酶量、pH值和酶解溫度，故選取這4 個因素進行單因素試驗，結果如圖1所示。由圖1A可知，杏鮑菇蛋白的得率隨著液料比的增加呈先增大后減小的趨勢，當液料比為30∶1時，蛋白得率達到最大為8.67%。這可能是因為溶液體積較小時，由于含水量低，底物與酶接觸不充分，導致得率較低；隨著含水量增加，底物與酶作用充分；繼續增加水量而底物含量不變，酶與底物的結合機率下降，使得率減小［21］。由圖1B可知，隨著加酶量的增加，蛋白得率先增加后趨向平緩，在加酶量取2.5%時達到最大。其中可能的原因是加酶量低導致細胞壁骨架不能被有效降解，細胞壁沒有充分溶解，細胞內含物質釋放不完全，導致提取率低［22］，當加酶量足夠時，細胞壁被充分降解，蛋白從細胞中被釋放出來，提高得率。由圖1C可知，pH值為5～7時，蛋白得率隨著pH值的增加而增加，而纖維素酶的最適作用pH值在5左右，這可能是因為纖維素酶酶解細胞壁釋放細胞內含物是影響蛋白得率的關鍵因素之外［23］，溶液的酸堿度對促進蛋白溶解也起到了至關重要的作用［24］，在這個pH值范圍內，兩者對蛋白質的溶解起到了良好的共同促進效應；而當pH值為8時，蛋白得率有所下降，可能是因為此時纖維素酶的活性受到較大影響，酶解作用降低；當pH值繼續增加到9時，蛋白得率增加，這很可能是堿溶作用，雖蛋白得率有所提高，但此反應pH值不溫和，故此pH值不予考慮。由圖1D可知，隨著溫度的增加，蛋白得率先增加后降低。在溫度為60 ℃時，蛋白得率最大，這與纖維素酶的最適作用溫度有關。溫度對底物水解作用有兩方面［25］：一方面溫度升高使分子活躍，增大酶分子與底物之間的碰撞概率，從而促進了水解作用，提高得率；另一方面溫度升高也加速酶的變性，降低酶活性，水解作用減弱，得率降低。因此，選取液料比30∶1、加酶量2.5%、pH 7和酶解溫度60 ℃作為響應面中心點。

圖1　4 個單因素對杏鮑菇蛋白得率的影響Fig.1　Effects of four single factors on the yield of Pleurotus eryngii protein

2.2響應面優化試驗

2.2.1響應面試驗設計及結果分析

響應面試驗設計與結果如表1所示。

表1　Box-Behnken試驗設計與結果Table1　Design and results of Box-Behnken experiments

2.2.2回歸模型的建立與顯著性分析

由表2回歸模型的方差分析可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬檢驗不顯著，說明回歸模型與實際情況擬合得很好，實驗誤差小，可用此模型對杏鮑菇蛋白得率進行分析及預測。模型中一次項X1與X4極顯著，X2、X3顯著；交互項X1X2、X2X3顯著；二次項均極顯著。

為了能更好地反映液料比與加酶量（X1X2）、加酶量與酶解pH值（X2X3）交互作用對杏鮑菇蛋白得率的影響規律，分別將模型中其他2 個因素固定在0水平，繪制出相應的三維曲面圖，如圖2所示。

表2　擬合多元二次方程模型的方差分析Table2　Analysis of variance for the fitted multivariate quadrati c equation model

圖2　兩顯著交互效應對杏鮑菇蛋白得率的影響Fig.2　Response surface plots showing the effects of interactions of enzyme/substrate ratio with water to solid ratio or initial pH on the yield of Pleurotus eryngi protein

圖2A表明了固定酶解pH 7、酶解溫度60 ℃，液料比與加酶量交互作用對杏鮑菇蛋白得率的影響。在加酶量1.5%～3.0%范圍內，液料比20∶1～35∶1范圍內時，兩者存在協同作用，得率隨著液料比和加酶量的增加而增加；而加酶量3%～3.5%范圍內，液料比35∶1～40∶1范圍內時，蛋白得率隨著2 個因素的增大并無增加，趨向平緩和降低。液料比和溫度分別為30∶1和60 ℃時，加酶量與pH值交互作用對蛋白得率的影響如圖2B所示。當加酶量固定不變時，隨著pH值的增加，蛋白得率先增加后降低；pH值一定時，蛋白得率隨著加酶量的增加而增加后趨向于平緩。

2.2.3最優化工藝條件及驗證

運用Design-Expert 8.0.6軟件所獲得杏鮑菇蛋白最佳提取工藝條件為：液料比為32.44∶1、加酶量為2.56%、pH 7.16、酶解溫度為59.09 ℃，將此條件代入擬合方程，計算出來的響應值杏鮑菇蛋白得率為10.30%。為了便于生產中的實際操作的可行性，將提取條件調整為液料比為35∶1、加酶量為2.6%、pH 7.2、酶解溫度為60 ℃，將此條件代入擬合方程，計算出來的響應值杏鮑菇蛋白得率為10.18%，通過驗證實驗，在此條件下的實際蛋白得率為（10.68±0.18）%，經SPSS軟件顯著性分析，實際蛋白得率與理論值差異不顯著（P＞0.05），因此證明該模型能很好地預測實驗結果。

2.2.4酶法提取與水提杏鮑菇蛋白比較

水提所得杏鮑菇蛋白得率為（6.10±0.49）%，酶法提取所得杏鮑菇蛋白得率（10.68±0.18）%明顯高于水提法。

2.3氨基酸結果分析

蛋白質中氨基酸種類齊全且符合FAO/WHO的氨基酸模式標準，則表示此蛋白質營養價值較高，適合人體生理需求。現通過實驗測得杏鮑菇蛋白粉中的氨基酸組成并對其組成成分進行分析，分析結果如表3、4所示。

表3　杏鮑菇蛋白粉氨基酸組成分析Table3　Amino acid composition of Pleurotus eryngii protein powder

由表3可知，杏鮑菇中的蛋白質中天冬氨酸和谷氨酸含量最高，Durand等［26］關于海馬LTP記憶參與功能依賴性突觸形成的假說中證實了谷氨酸在學習和記憶神經元可塑性方面均起重要作用。必需氨基酸占杏鮑菇蛋白粉總氨基酸含量的40%，符合WHO/FAO標準模式所規定的40%；而杏鮑菇蛋白中必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值為0.65，明顯符合WHO/FAO標準模式規定的0.60［27］，說明該蛋白粉具有很好的營養價值。

表4　杏鮑菇蛋白粉的RAA、RC及SRC分析Table4　Analysis of RAA， RC and SRC of Pleurotus erynnggii protein powder

本研究應用氨基酸系數比值法［28］，并選取已報道的動物蛋白中的雞蛋蛋白和植物中的大豆蛋白進行對比來評價杏鮑菇蛋白粉的營養價值。氨基酸比值（RAA）表示食品中蛋白質的含量相當于模式氨基酸的倍數；氨基酸比值系數（RC）反映食物中氨基酸組成含量與模式氨基酸的偏離程度［29］，RC值為1時，表明食物蛋白的氨基酸組成含量比例與模式氨基酸一致，偏離1則表示偏離氨基酸模式，RC值最小的氨基酸為限制氨基酸，由表4可知，含硫氨基酸（蛋氨酸和半胱氨酸）為杏鮑菇蛋白的第一限制氨基酸；氨基酸比值系數分（SRC）越接近100，蛋白質的營養價值越高，雞蛋蛋白和大豆蛋白的SRC值分別為84.09和61.22［30］，杏鮑菇蛋白的SRC為75.02。根據 SRC 值的大小進行3 種蛋白的營養排序：雞蛋蛋白＞杏鮑菇蛋白＞大豆蛋白，酶法制得的杏鮑菇蛋白的營養明顯較大豆蛋白更優，且接近于雞蛋蛋白。

3　結 論

本研究通過單因素試驗分析了纖維素酶法提取杏鮑菇蛋白的最優條件，并在此基礎上采用Box-Behnken響應面試驗設計得到最佳工藝參數：液料比為35∶1、加酶量為2.6%、pH 7.2、酶解溫度為60 ℃，該條件下杏鮑菇蛋白得率達10.68%，建立的回歸模型能很好地預測杏鮑菇蛋白得率。通過氨基酸含量測定及氨基酸系數比值法分析，可知杏鮑菇蛋白的必需氨基酸占杏鮑菇蛋白粉總氨基酸含量的40%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值為0.65，符合WHO/FAO的蛋白理想模式EAA/TAA比值在40%左右，EAA/NEAA值應大于0.60。該蛋白制品的氨基酸比值系數分75.02明顯高于大豆蛋白61.22。因此，證明了杏鮑菇蛋白的纖維素酶法提取可為工業化生產杏鮑菇蛋白產品提供有效的理論依據，并可為杏鮑菇蛋白的更深入研究提供理論基礎。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis for Preparing Pleurotus eryngii Protein by Response Surface Methodology and Nutritional Evaluation

ZHANG Mengtian1， YANG Wenjian1， PEI Fei1， ZHAO Liyan2， AN Xinxin2， MA Ning1， CHENG Wei3， HU Qiuhui1，*
（1. Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing， Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety， College of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics， Nanjing 210023， China；2. College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China； 3. Institute of Processing of Agricultural Produce and Nuclear Agricultural Research， Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan 430064， China）

The objectives of this study were to develop an optimized enzymatic method for extracting proteins from Pleurotus eryngii and to evaluate the nutritional value of the obtained proteins. Response surface methodology （RSM）based on a Box-Behnken design was used in combination with single factor experiments to establish the optimal hydrolysis conditions as follows： water to solid ratio， 35：1 （V/m）； enzyme/substrate ratio， 2.6% （on a dry weight basis）； initial pH， 7.2；and temperature， 60 ℃， leading to an extraction yield of 10.68%. Amino acid coefficient method was used to evaluate the nutritional value of the proteins extracted from Pleurotus eryngii. The essential amino acids/non-essential amino acid （EAA/ NEAA） value， essential amino acids/total amino acids （EAA/TAA） value and score of ratio coefficient （SRC） of the obtained proteins were 0.65， 0.40 and 75.02， respectively. This extraction procedure was simple and the obtained proteins had good quality so that it can be used in industrial production of Pleurotus eryngii protein products.

Pleurotus eryngii； protein； response surface methodology； amino acid composition

TS210.4

A

1002-6630（2015）13-0125-06

10.7506/spkx1002-6630-201513024

2015-01-27

公益性行業（農業）科研專項（201303080）

張夢甜（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：15251879082@163.com

胡秋輝（1962—），男，教授，博士，研究方向為食品與農產品加工。E-mail：qiuhuihu@njue.edu.cn