超高壓對風(fēng)味蛋白酶酶解大豆分離蛋白中P34 免疫活性的影響

鄭環(huán)宇，邵紅梅，趙丹丹，白小娟，朱秀清，韓建春，劉天一，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家大豆工程技術(shù)研究 中心，黑龍江 哈爾濱 150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江省大豆技術(shù)開發(fā)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

超高壓對風(fēng)味蛋白酶酶解大豆分離蛋白中P34 免疫活性的影響

鄭環(huán)宇1，2，3，邵紅梅2，趙丹丹2，白小娟2，朱秀清1，2，3，韓建春1，2，3，劉天一2，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家大豆工程技術(shù)研究 中心，黑龍江 哈爾濱 150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江省大豆技術(shù)開發(fā)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

研究超高壓對風(fēng)味蛋白酶處理大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）中致敏原P34免疫活性的影響。并對脫敏后的SPI功能特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：超高壓處理對風(fēng)味蛋白酶消除SPI中致敏原P34具有促進(jìn)作用，將消除P34致敏性的酶解時(shí)間由120 min縮短到了60 min。超高壓聯(lián)合風(fēng)味蛋白酶酶解脫敏的SPI溶解性、黏度、保水性、吸油性、乳化性和乳化穩(wěn)定性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性都比單純酶酶解的SPI明顯提高。

大豆；致敏蛋白；P34；超高壓；酶解

大豆蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源被廣泛應(yīng)用于食品和飼料業(yè)。但大豆蛋白中的一些致敏蛋白限制了其應(yīng)用領(lǐng)域，特別是在嬰幼兒食品和仔畜飼料中。目前已發(fā)現(xiàn)的大豆致敏蛋白多達(dá)38 種［1］，其中Gly m Bd 30K也稱為油脂體相關(guān)蛋白P34。屬于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族邊緣成員，是一種糖蛋白，糖基化位點(diǎn)位于成熟蛋白低170位天冬酰胺處，多糖組成為甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、巖藻糖、木糖，比例分別為3∶2∶1∶1［2-3］。P34中含有3 對二硫鍵，主要由α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)組成［4］。易引發(fā)過敏性皮炎，其特異性IgE抗體識別率高達(dá)65%［5］，是大豆蛋白中主要的致敏蛋白成分［6-8］，因此研究如何去除P34對降低大豆蛋白的致敏性具有重要意義。

超高壓技術(shù)也稱高靜壓技術(shù)，是一種新型的非熱加工手段，被譽(yù)為“當(dāng)今世界十大尖端科技之一”，也是食品加工高新技術(shù)［9-12］。超高壓通過影響蛋白質(zhì)的分子體積、非共價(jià)鍵等，引起蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而改變其活性［13］。生物酶技術(shù)是改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的有效手段。利用生物酶酶解蛋白可使蛋白質(zhì)的肽鏈發(fā)生斷裂，生成分子質(zhì)量更小的多肽或氨基酸，因此可利用酶解反應(yīng)降解致敏蛋白，破壞其致敏蛋白的分子結(jié)構(gòu)，從而降低其致敏性［14-15］。

本實(shí)驗(yàn)采用超高壓聯(lián)合風(fēng)味蛋白酶水解對大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）進(jìn)行處理，探討其對致敏性蛋白P34的免疫活性的影響，以期為開發(fā)脫敏大豆蛋白產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

SPI（蛋白質(zhì)含量92.5%） 哈爾濱高科技（集團(tuán)）股份有限公司。

風(fēng)味蛋白酶 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、β-巰基乙醇、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺、考馬斯亮藍(lán)R-250、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、預(yù)染的蛋白Marker（14.4～97 kD）、小鼠抗P34單細(xì)胞多克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、氮藍(lán)四唑、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

DYY-6C型電泳儀、DYY-24D型電泳槽、DYCZ-40D轉(zhuǎn)印電泳儀、水平搖床 北京六一儀器廠；GL-20B高速冷凍離心機(jī) 上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器廠；521-1恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器廠；水浴恒溫?fù)u床 上海天呈儀器廠；GJJ型超高壓均質(zhì)機(jī) 美國PHD科技有限公司；FD-1D-50型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1風(fēng)味蛋白酶酶解SPI樣品的制備

稱取一定質(zhì)量的SPI，以實(shí)際蛋白含量為準(zhǔn)，配制成實(shí)際蛋白質(zhì)含量為5%的SPI溶液，在4 800 r/min條件下高速均質(zhì)2 min，所得溶液備用。取上述溶液調(diào)節(jié)pH 7.0，溫度50 ℃后，按照酶活力為1 000 U/g SPI加入風(fēng)味蛋白酶，在水浴恒溫?fù)u床中分別酶解一定時(shí)間，期間不斷控制pH值使其保持不變，然后100 ℃沸水浴滅酶15 min，冷卻，經(jīng)真空冷凍干燥后冷藏備用。

1.2.2超高壓聯(lián)合風(fēng)味蛋白酶酶解SPI樣品的制備

為探究超高壓聯(lián)合風(fēng)味蛋白酶對消除大豆蛋白致敏原P34的影響，將SPI先經(jīng)過超高壓處理，再經(jīng)風(fēng)味蛋白酶酶解。具體步驟為：稱取一定質(zhì)量的SPI，以實(shí)際蛋白含量為準(zhǔn)，配制成實(shí)際蛋白質(zhì)含量為5%的SPI溶液，在4 800 r/min條件下高速均質(zhì)2 min，所得溶液備用。取上述溶液經(jīng)超高處理（壓力為600 MPa，保壓時(shí)間為20 min）后，調(diào)節(jié)pH 7.0，溫度50 ℃后，按照酶活力為1 000 U/g SPI加入風(fēng)味蛋白酶，在水浴恒溫?fù)u床中分別酶解一定時(shí)間，期間不斷控制pH值使其保持不變，然后100 ℃沸水浴滅酶15 min，冷卻，經(jīng)真空冷凍干燥后冷藏備用。

1.2.3蛋白酶酶活力的測定

參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》中的福林-酚法進(jìn)行測定。

1.2.4蛋白酶解物水解度的測定

參照趙新淮等［16］方法進(jìn)行。

1.2.5SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

量取0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的SPI溶液置于1.5 mL離心管中，加入1 mL Tris-HCl（pH 8.2）緩沖液，渦旋混勻，超聲30 min（每間隔10 min渦旋混勻一次）后，10 000 r/min離心30 min，取上清液，通過Bradford法測定其蛋白質(zhì)含量。

利用SDS-PAGE法，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%，交聯(lián)度為3.6%，進(jìn)行垂直電泳，濃縮膠壓力為100 V，分離膠壓力為150 V，恒壓運(yùn)行2 h。根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)的定量分析，將蛋白質(zhì)樣品適當(dāng)稀釋與質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%溴酚藍(lán)緩沖液按1∶1混合后制備成蛋白質(zhì)量濃度為2 μg/μL的上樣液，沸水浴煮沸5 min，冷卻后加樣，加樣量為10 μL，電泳完畢后，采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色40 min，然后經(jīng)電泳脫色液脫色，待蛋白帶清晰后照相保存。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法對P34免疫活性的定量分析

采用間接酶聯(lián)免疫法［17］，通過測定大豆蛋白致敏原P34在450 nm波長處的光密度（OD）值來說明P34的致敏性，并以SPI提取液和空白作對照，結(jié)果以致敏性殘存率表示P34致敏性的變化。計(jì)算公式如下。

1.2.7Western blotting法對P34免疫活性的定性分析

通過觀察大豆蛋白致敏原P34在Western blotting圖譜中相應(yīng)譜帶的顏色深淺變化和有無，來說明其致敏性的強(qiáng)弱和有無，具體操作見參考文獻(xiàn)［17］。

1.2.8脫敏SPI的功能特性研究

1.2.8.1溶解性的測定

溶解性以氮溶解指數(shù)（nitrogen solubility index，NSI）表示，分別稱取2 g脫敏SPI（SPI作對照），加入50 mL去離子水，配制成一定濃度的蛋白質(zhì)溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.0，攪拌30 min后離心（2 000 r/min，15 min），測定上清液中氮含量，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，以平均數(shù)表示測定結(jié)果。樣品中上清液與總氮含量均采用凱氏定氮法測定，NSI的計(jì)算公式如下。

1.2.8.2黏度的測定

采用毛細(xì)管黏度計(jì)法測定：配制底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的脫敏SPI（SPI作對照）溶液，用 NDJ-8S型黏度計(jì)測定其黏度，重復(fù)測定3 次，結(jié)果取平均值表示。

1.2.8.3吸油性的測定

準(zhǔn)確稱取3.00 g脫敏SPI（SPI作對照），加入大豆油9 mL，攪拌均勻后室溫放置30 min，使之充分吸油，然后離心（7 500 r/min，30 min），除去液體后，測定殘留物的質(zhì)量，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，結(jié)果取平均值表示。

1.2.8.4保水性的測定

準(zhǔn)確稱取5.00 g脫敏SPI（SPI作對照）加入50 mL去離子水，攪拌均勻后室溫放置30 min，然后離心（4 500 r/min，30 min）分離出上清液，測定殘留物質(zhì)量，同時(shí)測定上清液中的氮含量轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)質(zhì)量，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，結(jié)果取平均值。

1.2.8.5乳化性（emulsion ability，EA）及乳化穩(wěn)定性（emulsion stability index，ESI）的測定

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%脫敏SPI溶液（SPI作對照）15 mL，大豆油5 mL，高速乳化均質(zhì)機(jī)以一定速率均質(zhì)40 s，連續(xù)3 次共計(jì)2 min，制成乳濁液后，立即用微量注射器從底部3 個(gè)不同點(diǎn)分別抽取20 μL乳狀液放入3 支試管中，再各加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% SDS混勻，用0.1%的SDS作為空白，在500 nm波長處記錄此時(shí)的吸光度（A0），以此表示EA。30 min后，同樣方法再抽取20 μL測定吸光度（At）。其計(jì)算公式如下。

式中：t為30 min。

1.2.8.6起泡性（foaming capacity，F(xiàn)C）及泡沫穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S）的測定

取100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%脫敏SPI溶液（SPI作對照），置于500 mL量筒中，使用高速乳化均質(zhì)機(jī)以一定速率均質(zhì)40 s，連續(xù)3 次共計(jì)2 min，記錄均質(zhì)后液面高度記為V0，靜置30 min后記錄液面高度，記為Vt。計(jì)算公式如下。

2　結(jié)果與分析

2.1SPI的蛋白亞基組成及致敏原P34免疫活性驗(yàn)證

SPI的SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示，其中電泳圖譜中顏色較深的相關(guān)條帶分別為β-伴大豆球蛋白的α'亞基、β-伴大豆球蛋白的α亞基、β-伴大豆球蛋白的β亞基、11S大豆球蛋白的G1酸性鏈和G2堿性鏈、P34（Gly m Bd 30K）。為了進(jìn)一步明確SPI中大豆蛋白致敏原P34的致敏性是否存在及其在電泳圖中的位置，進(jìn)行了P34的免疫印跡（Western blotting）測定，結(jié)果如圖2所示。大豆蛋白致敏原P34在SPI中存在致敏性，并且活性很強(qiáng)。大豆蛋白致敏原P34在電泳圖中的位置大約近于分子質(zhì)量為31 kD的條帶處。

圖1　大豆分離蛋白的SDS-PAGE圖Fig.1　SDS-PAGE of soybean protein isolate

圖2　大豆蛋白致敏原P34的Western blotting圖Fig.2　Western blotting pattern of soybean protein P34

2.2超高壓處理對風(fēng)味蛋白酶酶解SPI水解度的影響

圖3　超高壓處理對風(fēng)味蛋白酶水解SPI反應(yīng)水解度的影響Fig.3　Effect of ultra-high pressure on hydrolysis degree of SPI by flavourzyme

為了研究超高壓對風(fēng)味蛋白酶酶解SPI水解度的影響效果，以未經(jīng)超高壓處理而直接酶解的SPI進(jìn)行對比。由圖3可知，在各個(gè)時(shí)間下，經(jīng)超高壓處理后再用風(fēng)味蛋白酶酶解SPI的水解度明顯高于未經(jīng)超高壓處理的SPI的水解度，說明超高壓處理有助于加速風(fēng)味蛋白酶對SPI的酶解，超高壓聯(lián)合酶酶解優(yōu)于單純酶酶解反應(yīng)效果。經(jīng)超高壓處理后的SPI，酶解時(shí)間90 min時(shí)水解度達(dá)到最大，時(shí)間繼續(xù)延長，水解度基本保持不變。而未經(jīng)超高壓處理的SPI，酶解120 min時(shí)水解度才達(dá)到最大值，并且單純用風(fēng)味蛋白酶酶解SPI的水解度均低于超高壓聯(lián)合酶酶解處理SPI酶的水解度。

2.3超高壓對風(fēng)味蛋白酶酶解SPI中P34含量和蛋白質(zhì)組成的影響

圖4　超高壓處理對風(fēng)味蛋白酶酶解SPI反應(yīng)產(chǎn)物SDS-PAGE圖譜的影響Fig.4　SDS-PAGE of SPI hydrolyzed with flavourzyme combined with or without ultra-high pressure

由圖4可知，未經(jīng)超高壓處理的SPI在風(fēng)味蛋白酶酶解120 min時(shí)，大豆蛋白致敏原P34的譜帶才完全消失，而經(jīng)超高壓處理的SPI只需經(jīng)風(fēng)味蛋白酶酶解60 min，P34的譜帶就已完全消失，說明超高壓處理有助于風(fēng)味蛋白酶對大豆蛋白致敏原P34的降解。從電泳圖中可以看到，經(jīng)超高壓處理后酶解物中小分子蛋白明顯增加，這可能是由于超高壓環(huán)境下，大豆蛋白分子發(fā)生解離，暴露出更多的風(fēng)味蛋白酶作用位點(diǎn)，從而生成更多的小分子蛋白。

2.4超高壓對風(fēng)味蛋白酶酶解SPI中P34致敏性的影響

圖5　超高壓處理對風(fēng)味蛋白酶酶解SPI產(chǎn)物中P34致敏性的影響Fig.5　Effect of ultra-high pressure on allergenicity of P34 in flavourzyme hydrolysate of SPI

由圖5可知，不同酶解時(shí)間下，經(jīng)超高壓聯(lián)合酶法處理的SPI中P34的致敏性明顯低于單純用酶酶解的SPI。并且經(jīng)超高壓處理后的SPI酶解60 min時(shí)，SPI中P34的致敏性為0。而未經(jīng)超高壓處理的SPI則需酶解120 min，SPI中P34的致敏性才能完全消除。這一分析結(jié)果與電泳分析結(jié)果相一致。

綜合以上分析，超高壓處理能夠明顯提高風(fēng)味蛋白酶對大豆蛋白致敏原P34的降解效率，確定出超高壓聯(lián)合風(fēng)味蛋白酶消除大豆蛋白致敏原P34的最佳工藝條件為：超高壓壓力600 MPa，保壓20 min后，經(jīng)風(fēng)味蛋白酶在pH 7.0，溫度50 ℃條件下，酶解60 min。

2.5脫敏SPI中大豆蛋白致敏原P34免疫活性的驗(yàn)證

圖6　超高壓聯(lián)合風(fēng)味蛋白酶脫敏SPI中P34的Western blotting圖Fig.6　Western blotting profile of P34 in SPI subjected to combined treatment with flavourzyme and ultra high pressure

由圖6可知，經(jīng)超高壓聯(lián)合風(fēng)味蛋白酶脫敏的SPI在Western blotting圖譜中P34的相應(yīng)位置上沒有譜帶，因此說明超高壓聯(lián)合風(fēng)味蛋白酶脫敏的方法能將SPI中致敏原P34完全脫除，與SDS-PAGE圖譜和ELISA結(jié)果一致。

2.6脫敏SPI的功能特性

為了使去除大豆致敏蛋白P34的脫敏SPI得到更好的應(yīng)用，對脫敏SPI的功能特性進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖7。

圖7　脫敏SPI的功能特性Fig.7　Functional properties of desensitized SPI

由圖7A可知，經(jīng)酶法處理和超高壓聯(lián)合酶法處理后的SPI溶解性都明顯增加，其中超高壓聯(lián)合酶法處理的脫敏SPI的溶解性高于酶法處理的脫敏SPI。由圖7B可知，兩種脫敏大豆蛋白的黏度都明顯降低，其中超高壓聯(lián)合酶法處理的脫敏SPI的黏度略高于酶法處理的SPI。由圖7C可知，兩種脫敏SPI的保水性都明顯增加，其中超高壓聯(lián)合酶法處理的脫敏SPI的保水性要高于酶法處理的SPI。由圖7D可知，兩種脫敏SPI的吸油性明顯降低，其中超高壓聯(lián)合酶法處理的脫敏SPI的吸油性要明顯高于酶法處理的脫敏SPI。由圖7E可知，兩種脫敏SPI的EA都降低，而ESI升高，其中超高壓聯(lián)合酶法處理的脫敏SPI的EA和ESI高于酶法處理的脫敏SPI。由圖7F可知，兩種脫敏SPI的FC都降低，而FS升高，其中超高壓聯(lián)合酶法處理的脫敏SPI的FC和FS高于酶法處理的脫敏SPI。

綜合以上分析，經(jīng)超高壓聯(lián)合風(fēng)味蛋白酶脫敏所得到的SPI不但P34的致敏性降低，而且產(chǎn)物的溶解性、黏度、吸水性、吸油性、EA、ESI、FC、FS都明顯好于只經(jīng)風(fēng)味蛋白酶降解所得到的脫敏SPI。這可能是因?yàn)镾PI在超高壓環(huán)境下，其蛋白質(zhì)的二級［18］、三級［19-21］和四級［22-24］結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，致使蛋白質(zhì)的肽鏈中局部肽段的構(gòu)象、肽鏈中所有肽鍵和殘基（包括側(cè)鏈）間的相對位置或亞基結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。從而使蛋白中具有活性的基團(tuán)發(fā)生改變、暴露或隱藏，增加了風(fēng)味蛋白酶的作用位點(diǎn)，不但能加速其降解P34的能力，還能使其水解物的功能特性得到更好地改善。

3　結(jié) 論

超高壓聯(lián)合風(fēng)味蛋白酶消除大豆蛋白致敏原P34的最佳工藝條件為：超高壓壓力600 MPa，保壓20 min后，經(jīng)風(fēng)味蛋白酶在pH 7.0，溫度50 ℃條件下，酶解60 min。超高壓處理對風(fēng)味蛋白酶消除大豆蛋白致敏原P34具有促進(jìn)作用，在此最佳條件下，將消除P34致敏性的酶解時(shí)間由120 min縮短到了60 min。超高壓聯(lián)合風(fēng)味蛋白酶酶解脫敏的SPI部分功能特性明顯優(yōu)于只經(jīng)風(fēng)味蛋白酶酶解脫敏的SPI。

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Effect of Ultra-High Pressure on Allergenicity of Soybean Protein P34 and Functional Properties of Soybean Protein Isolate

ZHENG Huanyu1，2，3， SHAO Hongmei2， ZHAO Dandan2， BAI Xiaojuan2， ZHU Xiuqing1，2，3， HAN Jianchun1，2，3， LIU Tianyi2，*
（1. National Research Center of Soybean Engineering and Technology， Northeast Agricultural University， Harbin 150028， China；2. College of Food Science， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China； 3. Soybean Technology Development Research Center of Heilongjiang Province， Harbin 150030， China）

The effect of ultra-high pressure （UHP） combined with enzymatic hydrolysis on the allergenicity of P34 in soybean protein isolate （SPI） and the functional properties of desensitized SPI was studied. The results showed that ultra-high pressure could accelerate the hydrolysis process to eliminate the immune activity of soybean protein P34 using flavourzyme and improve the hydrolysis efficiency by 50%. The solubility， viscosity， emulsification， water-holding capacity， oil-absorbing capacity， emulsion stability， foaming capacity and foam stability of SPI subjected to the combined treatment of ultra-high pressure and hydrolysis were improved obviously when compared with the latter alone.

soybean； allergenic protein； P34； ultra-high pressure； hydrolysis

TQ936.2

A

1002-6630（2015）13-0095-06

10.7506/spkx1002-6630-201513019

2014-11-01

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102208）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B04）

鄭環(huán)宇（1975—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)榇蠖咕罴庸ぁ-mail：841625891@qq.com

劉天一（1980—），女，講師，博士，研究方向?yàn)榧Z油加工。E-mail：ltyone80@gmail.com