雞胸軟骨Ⅱ型膠原免疫活性肽的制備及其性質

劉露露，曹　慧*，徐　斐，于勁松，袁　敏

（上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093）

雞胸軟骨Ⅱ型膠原免疫活性肽的制備及其性質

劉露露，曹慧*，徐斐，于勁松，袁敏

（上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093）

以水解度為指標，優化了中性蛋白酶酶解雞胸軟骨Ⅱ 型膠原的條件，在此基礎上制備不同水解度Ⅱ型膠原酶解復合物，并以淋巴細胞增殖率為指標對其免疫活性進行研究。結果表明，中性蛋白酶的酶解能力最強，其最佳酶解條件為：酶解溫度50 ℃、pH 7.5、底物質量濃度25 mg/mL、加酶量40 U/mg、酶解時間150 min。當Ⅱ型膠原在水解度為18%時，其對淋巴細胞的增殖活性達到58.69%。Ⅱ型膠原酶解復合物的質量濃度對淋巴細胞的增殖率也有顯著影響，當其質量濃度達到1 mg/mL時，對淋巴細胞增殖能力達到最大。免疫活性較高的Ⅱ型膠原酶解復合物的分子質量主要分布于1 000～180 D范圍內，占其總含量的75.21%。

Ⅱ型膠原；免疫活性肽；中性蛋白酶；淋巴細胞增殖活性

Ⅱ型膠原免疫活性肽是指以Ⅱ型膠原為原料制備的對機體的免疫功能具有生理調節作用的肽類化合物［1-2］。它能夠刺激淋巴細胞增殖，增強巨噬細胞的吞噬能力，而且不會引起機體的免疫排斥反應［3］。近年來研究發現，類風濕性關節炎的發病與Ⅱ型膠原的自身免疫反應有關，通過口服Ⅱ型膠原來誘導免疫耐受對類風濕性關節炎具有顯著防治作用［4-6］。進一步研究顯示，Ⅱ型膠原中的免疫活性肽能與人類的白細胞抗原HLA-DR4相結合，形成的復合物再經分泌途徑呈現于抗原遞呈細胞（antigen processing cells，APCs）細胞表面，供受體特異性T細胞表面受體（T cell receptor，TCR）所識別，進一步結合成TCR-HLA/DR4-抗原肽三分子復合體，T細胞被活化、增殖并分泌各種免疫因子而啟動免疫應答［7-12］。因而，本實驗以雞胸軟骨Ⅱ型膠原為原料，采用酶法制備Ⅱ型膠原免疫活性肽，并對其免疫活性進行了研究，以期為免疫活性肽的開發提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

Ⅱ型膠原 上海理工大學醫療器械與食品學院資源綜合利用實驗室自制［13］。

中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶 江蘇銳陽生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶 國藥集團化學試劑有限公司；淋巴細胞 上海拜力生物科技有限公司。

1.2儀器與設備

BX41顯微鏡 奧林巴斯有限公司；TLID-2005袖珍型低溫恒溫槽 寧波天恒儀器廠；UV-6000 PC紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；Biocell ht2酶標儀 鄭州博賽生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1不同蛋白酶酶解Ⅱ型膠原條件的優化

將制備的雞胸軟骨Ⅱ型膠原［13］溶解于雙蒸水中，并配制成一定質量濃度的溶液，置于酶反應器中，調節反應所需的溫度和pH值，然后向其中加入不同蛋白酶，使其在各自最適的條件下進行酶解。于酶解過程中，不斷向反應體系中加入0.5 mol/L的氫氧化鈉維持其所需pH值，并記錄堿液消耗量，酶解一定時間后，沸水浴中滅酶10 min，終止酶解反應。根據反應過程中消耗的堿量及水解度計算公式可計算出不同蛋白酶對Ⅱ型膠原的水解度［14-15］。

式中：V為NaOH標準溶液體積/mL；c為NaOH標準溶液濃度/（mol/L）；α為氨基離解度；m為底物中蛋白質總量/g；htot為底物蛋白質肽鍵總數/（mmol/g）。

在最優水解酶的基礎上考察酶解溫度（40、50、60 ℃）、pH值（6.5、7、7.5）、底物質量濃度（20、25、30 mg/mL）、加酶量（20、30、40 U/mg）及酶解時間（0～300 min）對中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原能力的影響。

1.3.2不同水解度Ⅱ型膠原酶解物的制備

取一定量的雞胸軟骨Ⅱ型膠原［13］，用雙蒸水配制成25 mg/mL的溶液，放置在酶反應器中，根據1.3.1節中的反應條件進行酶解。達到一定的水解度后立即取出，沸水浴滅酶活10 min。冷凍干燥得到固體樣品，貯藏于4 ℃備用。

1.3.3不同水解度Ⅱ型膠原免疫活性的測定

于96 孔培養板中加入100 μL小鼠脾淋巴細胞懸液（1×106～2×106mL），再各加入100 μL不同水解度Ⅱ型膠原樣品，混勻后，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養68 h。在無菌的條件下向每孔加入10 μL噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），混勻，繼續培養4 h，再向每孔加入100 μL二甲基亞砜，室溫下放置10 min。采用酶聯免疫檢測儀于570 nm波長處測定吸光度，以培養液作為對照。

式中：A對照為對照組樣品在570 nm波長處的吸光度；A實驗為各樣品在570 nm波長處的吸光度。

1.3.4不同水解度Ⅱ型膠原酶解物分子質量分布的測定采用高效凝膠過濾色譜法測定Ⅱ型膠原酶解復合物分子質量的分布情況。色譜條件：色譜柱：TSKgel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動相：乙腈-水-三氟乙酸（40∶60∶0.1，V/V）；檢測：UV220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃。上柱樣品制備：分別稱取適量分子質量標樣和樣品溶于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，微孔濾膜過濾后進樣。凝膠過濾色譜柱分子質量標準：細胞色素C（Mw12 500）、桿菌酶（Mw1 450）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（Mw451）及乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（Mw189）。

1.4統計分析

以上指標測定重復3 次，數據用3 次平均值表示，采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。

2　結果與分析

2.1不同蛋白酶對Ⅱ型膠原蛋白酶解能力的比較

圖1　不同蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的動力學曲線Fig.1　Hydrolysis curves for type II collagen with different proteases

以水解度為指標比較了幾種蛋白酶在相同加酶量（30 U/mg）以及各自最適條件下對膠原蛋白的酶解效果，如圖1所示。中性蛋白酶在最適酶解條件下，對Ⅱ型膠原水解度顯著高于其他酶類（P＜0.01）。中性蛋白酶能最大程度地酶解膠原蛋白，其水解度為25.10%。這可能因為中性蛋白酶來源于枯草芽孢桿菌，可裂解蛋白質中的Tyr、Trp、Phe等氨基酸的肽鍵，是溫和的蛋白質水解內切酶，對很多蛋白質和肽類有酶解作用，因此選用中性蛋白酶作為酶解Ⅱ型膠原蛋白的工具酶。

2.2中性蛋白酶對Ⅱ型膠原酶解條件的優化

2.2.1酶解溫度對Ⅱ型膠原蛋白水解度的影響

在pH值為7、底物質量濃度為25 mg/mL、加酶量30 U/mg、酶解時間300 min的條件下，考察不同酶解溫度（40、50、60 ℃）對中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的影響，結果如圖2所示。酶解溫度在50 ℃時，中性蛋白酶對Ⅱ型膠原的水解度顯著高于其他溫度（P ＜0.01），在酶解溫度為50 ℃時酶解程度最大，為26.08%。這可能是由于50 ℃時能夠達到中性蛋白酶催化酶解反應所需的活化能，反應速率加快；而溫度過高或過低，會對中性蛋白酶的結構和活性產生影響，酶活性受到抑制，導致酶解能力降低。因此選擇50 ℃作為中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的最適溫度。

圖2　酶解溫度對Ⅱ型膠原水解度的影響Fig.2　Effect of temperature on type II collagen hydrolysis

2.2.2酶解pH值對Ⅱ型膠原蛋白水解度的影響

在酶解溫度50 ℃、底物質量濃度25 mg/mL、加酶量30 U/g、酶解時間300 min的條件下考察不同pH值（6.5、7、7.5）對中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的影響。結果如圖3所示。

圖3　酶解pH值對Ⅱ型膠原蛋白水解度的影響Fig.3　Effect of pH on hydrolysis efficiency of type II collagen

由圖3可知，中性蛋白酶對Ⅱ型膠原蛋白的酶解能力隨pH值的升高而顯著增大（P＜0.01），當pH值為7.5時酶解程度達到最高。這可能是因為在酸性條件下，中性蛋白酶與底物所帶電荷發生變化，導致中性蛋白酶的立體構象產生變化，從而改變了其與Ⅱ型膠原之間的親和力，導致催化能力下降，進而Ⅱ型膠原水解度被降低。酶的最適pH值會受底物種類、質量濃度以及緩沖液組成等多種因素的影響，故而其最適pH值不是一個常數，只有在一定的條件下才有意義。因此選擇pH 7.5作為中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的最適pH值。

2.2.3底物質量濃度對Ⅱ型膠原水解度的影響

在酶解溫度50 ℃、pH值為7.5、加酶量30 U/g、酶解時間為300 min的條件下，考察不同底物質量濃度（20、25、30 mg/mL）對中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的影響，結果如圖4所示。

圖4　底物質量濃度對Ⅱ型膠原水解度的影響Fig.4　Effect of substrate concentration on hydrolysis of type II collagen

由圖4可知，Ⅱ型膠原質量濃度為25 mg/mL時，中性蛋白酶對Ⅱ型膠原的水解度顯著高于其他質量濃度（P＜0.01）。這是由于高質量濃度Ⅱ型膠原降低了水的有效濃度，阻礙了分子擴散，從而降低了酶促反應速率；同時質量濃度過高，使得反應體系過于黏稠，不利于反應的操作和進行。因此選擇25 mg/mL作為中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的最佳底物質量濃度。

2.2.4加酶量對Ⅱ型膠原水解度的影響

在酶解溫度為50℃、pH值為7.5、底物質量濃度為25 mg/mL、酶解時間為300 min的條件下，考察不同加酶量（20、30、40 U/g）對中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的影響，結果如圖5所示。

圖5　加酶量對Ⅱ型膠原水解度的影響Fig.5　Effect of enzyme concentration on hydrolysis efficiency of type II collagen

由圖5可知，Ⅱ型膠原水解度隨酶解時間的延長、加酶量的增大而顯著增加（P＜0.01）。當加酶量為40 U/mg時中性蛋白酶對Ⅱ型膠原的酶解程度與30 U/mg時的水解度差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于20 U/mg時水解度（P＜0.01）。因此選擇40 U/mg作為中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的最佳加酶量。

2.2.5最適酶解條件下中性蛋白酶對Ⅱ型膠原的酶解動力學曲線

綜合以上單因素試驗結果，得出中性蛋白酶對Ⅱ型膠原的最佳酶解參數分別為：酶解溫度50 ℃、pH 7.5、底物質量濃度25 mg/mL、加酶量40 U/mg。根據此最佳酶解條件繪制中性蛋白酶對Ⅱ型膠原的酶解動力學曲線。

圖6　中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的動力學曲線Fig.6　Hydrolysis curve for type II collagen with neutral protease

由圖6可知，在最適酶解條件下，Ⅱ型膠原水解度隨酶解時間的延長呈增長趨勢，最后趨于平緩。中性蛋白酶具有一定專一性的酶，有其特定的肽鍵作用位點，隨著酶解反應的進行，蛋白底物的特定的肽鍵會越來越少，反應速率也會越來越慢。因此蛋白酶的酶解作用大多集中在前60～120 min。此外，隨著反應的進行，酶的活力會有所下降，這也是制約中性蛋白酶進一步酶解Ⅱ型膠原的原因之一。

2.3不同水解度Ⅱ型膠原酶解復合物的免疫活性

根據中性蛋白酶酶解Ⅱ型膠原的最佳條件，制備不同水解度的Ⅱ型膠原酶解復合物，并對其淋巴細胞增殖活性進行測定，結果如圖7所示。

圖7　不同水解度Ⅱ型膠原酶解復合物促進淋巴細胞的增殖能力Fig.7　Effect of enzymatic hydrolysates with different DH fro m type II collagen on the proliferation of lymphocytes

由圖7可知，不同水解度Ⅱ型膠原酶解復合物對淋巴細胞均有一定的增殖作用，且酶解復合物促進淋巴細胞增殖能力隨水解度的增加呈先增強后降低的趨勢。當Ⅱ型膠原水解度達到18%時，酶解復合物促進淋巴細胞增殖能力達到最高，為58.69%。這可能是由于在水解的初始，Ⅱ型膠原中的多肽鏈緊密折疊在一起，其具有免疫活性的氨基酸殘基或基團被包埋在分子內部，從而活性較低。隨著酶解反應的進行，大分子肽段被切割，釋放出具有免疫活性的小分子肽和游離氨基酸，暴露出能夠參與反應的氨基酸側鏈基團，從而使其免疫活性得以表現。但肽段的免疫活性與氨基酸的排列順序、空間結構和數量有關，當進一步水解，具有免疫活性的肽段被水解成更小的肽段或游離氨基酸，從而使該肽段喪失了免疫活性。

2.4Ⅱ型膠原酶解復合物質量濃度對淋巴細胞增殖能力的影響

圖8　Ⅱ型膠原酶解復合物的質量濃度對促進淋巴細胞增殖能力的影響Fig.8　Effect of enzymatic hydrolysate concentration from type II collagen on the proliferation of lymphocytes

由圖8可知，淋巴細胞增殖能力隨Ⅱ型膠原酶解復合物質量濃度的增加呈顯著增強的趨勢（P＜0.01）。當酶解復合物質量濃度達到1 mg/mL時，淋巴細胞增殖率趨于穩定，達到59.93%。這可能是因為較高質量濃度的Ⅱ型膠原酶解復合物有利于其抗原表位與APC表面的HLAⅡ類分子相結合，并形成HLA-抗原肽復合物，該復合物可與T細胞表面受體分子發生特異性結合，進而激活自身反應性T淋巴細胞的免疫應答，使其活化并促進淋巴細胞的增殖。

2.5Ⅱ型膠原酶解復合物分子質量的分布

采用高效凝膠過濾色譜法對淋巴細胞增殖能力在最低（水解度5%）和最高（水解度18%）時的Ⅱ型膠原酶解復合物的分子質量分布進行測定，其洗脫曲線如圖9、10所示，酶解復合物分子質量分布如表1所示。

圖9　水解度為55%時Ⅱ型膠原酶解復合物分子質量分布Fig.9　Molecular weight distribution profile of enzymatic hydrolysates with 5% DH from type II collagen

圖10　水解度為18%時Ⅱ型膠原酶解復合物分子質量分布Fig.10　Molecular weight distribution profile of enzymatic hydrolysates with 18% DH from type II collagen

表1　水解度5%和18%Ⅱ型膠原酶解復合物的分子質量分布百分比Table1　Molecular weight distribution of enzymatic hydrolysates with 5% and 18 d 18% DH from type II collagen %

如圖9和圖10所示，隨著水解度的增大，Ⅱ型膠原酶解復合物的分子質量分布總體表現為大分子質量肽的含量逐漸減少，小分子質量肽的含量逐漸增加。由表1可知，水解度為18%時肽段的分子質量主要分布于1 000～180 D，含量達75.21%，而水解度為5%時分布于1 000～180 D的肽段僅占61.61%。結合淋巴細胞增殖實驗結果可知水解度為18%時Ⅱ型膠原酶解復合物促淋巴細胞增殖的能力最強，由此可以初步推斷Ⅱ型膠原酶解復合物的免疫活性與其分子質量有一定的相關性，分子質量在1 000～180 D的肽類物質可能是Ⅱ型膠原酶解復合物促進淋巴細胞增殖的主要活性來源。由于氨基酸的平均分子質量大約為120 D，因此對于分子質量為1 000～180 D的Ⅱ型膠原酶解復合物而言，大約2～8 個氨基酸組成的多肽可能對Ⅱ型膠原酶解復合物的免疫活性貢獻較大。Sakanaka等［16］研究也發現免疫活性較高的肽段主要分布于分子質量小于1 000 D的范圍內；Wang Jinshui等［17］從小麥面筋酶解復合物中篩選到分子質量小于4 200 D的免疫活性肽；徐明生［18］探討了卵白蛋白酶解復合物中不同分子質量肽段的免疫活性，發現小于3 000 D的肽段免疫活性最強；程云輝［19］篩選出具有較強免疫活性的麥胚蛋白酶解復合物，其分子質量小于1 000 D的組分比例為53.01%。這些研究都表明了分子質量較小的肽段具有較高的免疫活性。

3　結 論

中性蛋白酶對雞胸軟骨Ⅱ型膠原具有較高的水解能力，其最佳酶解條件為：酶解溫度50 ℃、pH 7.5、底物質量濃度25 mg/mL、加酶量40 U/mg、酶解時間150 min。Ⅱ型膠原在水解度為18%時對淋巴細胞的增殖能力達到最高，為58.69%。Ⅱ型膠原酶解產物濃度對淋巴細胞增殖能力也有顯著影響，當其質量濃度達到1 mg/mL時，對淋巴細胞增殖能力達到59.93%。淋巴細胞增殖能力較強的Ⅱ型膠原酶解復合物的分子質量主要分布于1 000～180 D范圍內，占總含量的75.21%。在今后的工作中，將利用各種分離技術對酶解復合物進行分離純化，以期獲得目標活性組分，并對其構效關系進行研究。

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Preparation and Properties of Immunologically Active Peptide from Type II Collagen from Chicken Sternal Cartilage

LIU Lulu， CAO Hui*， XU Fei， YU Jinsong， YUAN Min
（School of Medical Instrument and Food Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China）

The hydrolysis conditions of type II collagen from chicken sternal cartilage were optimized to obtain increased degree of hydrolysis （DH）. Based on the optimal hydrolysis parameters， enzymatic hydrolysates with different DHs were prepared， and then lymphocyte proliferation test was utilized to evaluate their immunological activ ity. The results showed that neutral protease was the most suitable enzyme for hydrolyzing type II collagen and the optimal hydrolysis conditions were hydrolysis temperature of 50 ℃， hydrolysis pH of 7.5， collagen concentration of 25 mg/mL， enzyme dosage of 40 U/mg，and hydrolysis time of 150 min. The hydrolysates with a DH of 18% could result in proliferation of lymphocytes by up to 58.69%， and the maximal proliferative activity of lymphocytes was found at a concentration of 1 mg/mL. The molecular weight distribution of collagen hydrolysates with higher immunological activity was 1 000-180 D （accounting for 75.21% of the total hydrolysates）.

type II collagen； immunologically active peptide； neutral protease； lymphocyte proliferation

TS202.3

A

1002-6630（2015）13-0084-05

10.7506/spkx1002-6630-201513017

2014-08-31

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102207）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31201421）

劉露露（1991—），女，碩士研究生，研究方向為功能性配料及添加劑。E-mail：liululu511@126.com

曹慧（1976—），女，副教授，博士，研究方向為功能性配料及添加劑。E-mail：caohuian@126.com