黑曲霉菌降解黃曲霉毒素B1的影響因素的研究

陳志輝，徐馨，李仲玉，程寶晶，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161000）

黑曲霉菌降解黃曲霉毒素B1的影響因素的研究

陳志輝1，徐馨2，李仲玉1，程寶晶1，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161000）

谷物類原料因保管不善造成或加工過程中操作不當(dāng)易產(chǎn)生大量黃曲霉毒素B1。目前，微生物法已成為降解黃曲霉毒素B1的研究熱點(diǎn)。本研究用已篩選出具有降解黃曲霉毒素B1能力的黑曲霉菌為研究對(duì)象，從發(fā)酵液不同處理方式，熱穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性，金屬離子穩(wěn)定性等方面，對(duì)其降解的影響因素進(jìn)行了研究。通過對(duì)其發(fā)酵液不同處理途徑和不同條件對(duì)其降解黃曲霉毒素B1能力的影響的研究，初步判斷篩選菌株是通過直接代謝和分泌胞外酶兩種途徑共同降解黃曲霉毒素B1的，而分泌胞外酶又是其主要的降解黃曲霉毒素B1的手段，因此易受溫度、pH、和金屬離子的影響。

黃曲霉毒素B1；降解；黑曲霉菌；影響因素

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是由寄生曲霉和黃曲霉產(chǎn)生的具有強(qiáng)烈毒性的次生代謝產(chǎn)物，也是目前所有發(fā)現(xiàn)真菌類毒素中毒性最大的［1］。AFB1毒性是氰化鉀100倍，致癌作用是已知化學(xué)致癌物中最強(qiáng)的，致癌性比二甲基亞硝胺強(qiáng)75倍［2-3］。AFB1污染范圍廣泛，可發(fā)生在糧食、油料、干果、調(diào)味品、乳制品、肉類上，尤其以谷物原料最易受到污染，如果這些受到污染嚴(yán)重食物原料進(jìn)入到流通環(huán)節(jié)將嚴(yán)重威脅到消費(fèi)者的健康［4］。目前，微生物法以其節(jié)能、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，已成為去除或降低谷物原料中AFB1毒性的研究熱點(diǎn)［5］，但其降解的影響因素還不甚明了。本研究用本實(shí)驗(yàn)室已篩選出的具有降解AFB1能力的黑曲霉菌為研究對(duì)象，從發(fā)酵液不同處理方式，熱穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性，金屬離子穩(wěn)定性等方面，對(duì)其降解的影響因素進(jìn)行了研究。通過對(duì)其發(fā)酵液不同處理方式和不同因素對(duì)其降解AFB1能力的影響的研究，以其為更好利用微生物降解谷物原料中的AFB1，減少其對(duì)人類健康的威脅，為微生物法降解AFB1能夠在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用提供理論支持和科學(xué)參考。

1材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)菌株為本實(shí)驗(yàn)室自行篩選具有較好降解AFB1能力的一株黑曲霉菌（Aspergillus niger）。篩選菌株經(jīng)PDA瓊脂培養(yǎng)基活化，挑取生長較好菌落，接種于NB培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)24 h后，按3%接種于改良的馬丁氏培養(yǎng)基中，在34℃，pH 5.5，轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下培養(yǎng)48 h。

菌株發(fā)酵選用改良的馬丁氏培養(yǎng)基，配方為：淀粉40.0 g；胰蛋白胨5.0 g；酵母膏2.0 g；磷酸氫二鉀1.0 g；硫酸鎂0.5 g；去離子水1 000 mL；pH 5.5，121℃滅菌20 min。

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司；AFB1采用ELISA法測定，試劑盒購自北京百林康源公司。

1.2方法

1.2.1不同處理方式發(fā)酵液降解效果的比較

實(shí)驗(yàn)各分組方式見表1，空白組僅添加AFB1（使終濃度為10 μg/L，下同）；對(duì)照組既添加AFB1同時(shí)又接種篩選菌（接種量3%），其余3組處理方式如表1所示。

表1　各分組處理方式Table 1Approach of each group

將5組在32℃，200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。發(fā)酵培養(yǎng)后，對(duì)僅接種篩選菌的3組進(jìn)行再處理后，分別檢測各組對(duì)AFB1的降解率。

1.2.2溫度對(duì)發(fā)酵上清液降解效果的影響

1）高溫處理對(duì)離心上清液降解AFB1的影響。取1.2.1離心上清液，分別置于50℃和60℃水浴鍋中，保存2、4h和6h，取出后迅速置于冷水冷卻，添加AFB1，32℃，pH 6.0，200 r/min培養(yǎng)24 h，檢測AFB1降解率。

2）不同溫度對(duì)離心上清液降解AFB1效果的影響。取1.2.1離心上清液添加AFB1，分別在20、25、30、 35、40、45℃和50℃條件下，pH 6.0，200 r/min培養(yǎng)24 h，檢測AFB1降解率。

1.2.3pH對(duì)發(fā)酵上清液降解效果的影響

1）不同pH處理對(duì)離心上清液降解AFB1的影響。取1.2.1離心上清液，分別調(diào)節(jié)pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，4℃下放置3 h和6 h后，添加AFB1，32℃，pH 6.0，200 r/min培養(yǎng)24 h，檢測AFB1降解率。

2）不同pH對(duì)離心上清液降解AFB1效果的影響。取1.2.1離心上清液添加AFB1，分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0條件下，32℃，pH 6.0，200 r/min培養(yǎng)24 h，檢測AFB1的降解率。

1.2.4金屬離子對(duì)發(fā)酵上清液降解效果的影響

取1.2.1中離心上清液，添加AFB1，同時(shí)添加金屬離子（Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Pb2+、Fe2+、Fe3+），使其濃度均為c=5.0 mmol/L，32℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，檢測AFB1降解率。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理方式發(fā)酵液降解AFB1效果的比較

不同處理方式發(fā)酵液對(duì)AFB1的降解效果見表2。

表2　培養(yǎng)液不同處理方式對(duì)AFB1降解率的影響Table 2Degradation rate of AFB1by different approach of fermentation broth

發(fā)酵液加熱滅活24h內(nèi)對(duì)AFB1的降解率為5.9%、發(fā)酵液離心獲得的的上清液為43.4%，離心沉淀物經(jīng)超聲破碎后重新溶解液為0.8%，而空白組和對(duì)照組則分別為0.0%和58.4%，從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，3個(gè)處理組都達(dá)不到同時(shí)間活菌對(duì)照組的對(duì)AFB1降解率。降解效果分別只達(dá)到了對(duì)照組的10.1%、74.3%、1.4%。3個(gè)處理組降解率之和也僅為活菌對(duì)照組的85.8%，但其離心上清液仍然是主要降解源。

2.2溫度對(duì)離心上清液降解AFB1效果的影響

由表3可知，離心上清液AFB1降解率隨熱處理時(shí)間延長而降低；而且60℃處理組降解率下降幅度要高于50℃處理組，說明離心上清液對(duì)AFB1降解熱穩(wěn)定性差，在溫度較高比較容易失去降解能力。

離心上清液在不同溫度條件下對(duì)AFB1的降解率見表4。

由表可知，35℃以下時(shí)降解率隨著反應(yīng)溫度增大，AFB1的降解率隨之增加，而35℃后降解率則快速下降，因此，發(fā)酵上清液降解AFB1受溫度影響較大，而且35℃為離心上清液降解AFB1的最適溫度。

表3　高溫處理對(duì)離心上清液AFB1降解率的影響Table 3Effect of high temperature of the supernatant on degradation of AFB1%

表4　不同溫度處理對(duì)離心上清液降解AFB1的影響Table 4Effect of different temperatures on the supernatant degradation rate of AFB1%

2.3pH對(duì)離心上清液降解AFB1效果的影響

pH對(duì)離心上清液降解AFB1效果的影響見表5。

表5　不同pH處理對(duì)離心上清液降解AFB1的影響Table 5Effect of different pH of the supernatant on degradation rate of AFB1%

如表5所示，在pH呈弱堿性條件下（pH=7.0～9.0）時(shí)，離心上清液相對(duì)穩(wěn)定，處理3 h與處理6 h對(duì)其降解率的影響不大；pH<6.0時(shí)，離心上清液的降解效果較差，并且，其降解效果隨pH的降低和處理時(shí)間的加長而迅速下降。

由表6可知，pH<6.0時(shí)，離心上清液對(duì)AFB1的降解率迅速降低；pH>6.0時(shí)，對(duì)AFB1的降解率變化較為平緩緩慢，其中pH=6.0時(shí)，降解率最高。

2.4金屬離子對(duì)離心上清液降解AFB1效果的影響

不同金屬離子對(duì)離心上清液降解能力的影響見表7。

表6　不同pH對(duì)離心上清液降解AFB1的影響Table 6Effect of different pH of the supernatant on degradation rate of AFB1%

表7　添加金屬離子對(duì)離心上清液降解AFB1的影響Table 7Effect of different metal ion of the supernatant on degradation rate of AFB1

不同金屬離子對(duì)離心上清液的影響不盡相同，在c=5.0 mmol/L的濃度下，Li+、Na+、K+等堿金屬離子對(duì)可略微降低其降解能力；除Mn+2外，大多數(shù)二價(jià)陽離子對(duì)其降解能力均有較強(qiáng)的抑制作用；而Pb2+、Cu2+和Fe3+則對(duì)其表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。

3結(jié)論與討論

為研究篩選黑曲霉菌的降解AFB1的影響因素，本試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行了5種不同的處理方式。從試驗(yàn)結(jié)果看，對(duì)照組的降解率最高，離心上清組、加熱滅活組、離心沉淀組均低于對(duì)照組但也有一定的降解能力，說明黑曲霉菌對(duì)AFB1的降解是一個(gè)綜合的生物過程，而這3組降解能力之和也略低于對(duì)照組，可能是因?yàn)楹谇咕谏L過程中對(duì)AFB1存在一定的代謝能力。離心上清組的降解能力遠(yuǎn)高于加熱滅活組，這可能是因?yàn)楹谇咕鷮?duì)AFB1降解主要是通過一種熱不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的，初步猜測是一種胞外酶，而發(fā)酵上清液也是篩選菌株降解AFB1的主要場所。加熱滅活組、離心沉淀組也有一定的降解能力，說明在黑曲霉菌降解AFB1的過程中還有一部分非蛋白類物質(zhì)和胞內(nèi)酶的存在，這可能與黑曲霉菌代謝AFB1有關(guān)。但在本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，各處理組降解能力之和依然低于活菌對(duì)照組的降解能力，說明在發(fā)酵降解過程中，有一部分AFB1可能是通過被篩選菌株直接代謝降解掉的。

蛋白質(zhì)功能性會(huì)受到溫度、pH和金屬離子影響。溫度過低會(huì)降低酶促反應(yīng)k值，從而降低整個(gè)酶解反應(yīng)；溫度過高又會(huì)造成蛋白變性，使蛋白功能缺失。pH高低又會(huì)因?yàn)榈鞍椎入婞c(diǎn)不同，而使蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而使其生物學(xué)活性降低［6］。金屬離子又是條件酶活性的重要物質(zhì)，對(duì)酶的生物活性起到激活或抑制作用［7］。在以往研究中，經(jīng)常研究活性物質(zhì)是否會(huì)受到以上3個(gè)條件影響來判斷該生物活性物質(zhì)是否為一種酶。因此，本試驗(yàn)為進(jìn)一步確定發(fā)酵上清液中的具有降解AFB1的活性物質(zhì)是否為一種胞外酶，也針對(duì)這3個(gè)條件對(duì)離心上清液降解能力的影響進(jìn)行了研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)溫度增大，離心上清液中的AFB1降解率隨之增加，35℃為其最適作用溫度。溫度在30℃以下時(shí)，低溫時(shí)降解活性受抑制，而溫度升至40℃以上，其降解能力迅速下降；隨著熱處理時(shí)間延長，AFB1的降解率隨之降低；且溫度越高，活性喪失越嚴(yán)重，降解率越低。在60℃下處理6 h，保留了未處理前7%的活力，說明其對(duì)溫度較為敏感。

離心上清液的最適反應(yīng)pH為6.0～7.0，在酸性或過堿性條件下活性均較低。尤其是當(dāng)pH低于5時(shí)，酶活性降到不足最高活性的50%，這可能是由于pH下降，降低到了該酶的等電點(diǎn)，使其發(fā)生部分變性引起的；發(fā)酵上清液在pH呈弱堿性條件下（pH 7.0～9.0）時(shí)相對(duì)穩(wěn)定，pH小于6.0時(shí)活性迅速降低，這可能是由于pH降低，引起該酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，部分變性，從而導(dǎo)致活性降低。

有研究表明，Ca2+、Mg2+能明顯促進(jìn)黃色短桿菌去除毒素［8］。朱新貴等（2010）也得出結(jié)論添加Ca2+和Mg2+可促進(jìn)枯草桿菌對(duì)AFB1的去除［9］。本試驗(yàn)中，離心上清液中添加不同金屬離子對(duì)該降解酶的活力的影響有很大差異，在c=5.0 mmol/L的濃度下，一價(jià)堿金屬離子對(duì)其活性影響不顯著；除Mn2+外，大多數(shù)二價(jià)離子對(duì)酶活均有較強(qiáng)的抑制作用；而Pb2+、Cu2+和Fe3+則對(duì)其表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，這可能是由于重金屬使酶發(fā)生變性或者高價(jià)態(tài)離子使其氧化變性所致。而且與其他人所得到的結(jié)果不同［10-11］，本試驗(yàn)中所有的金屬離子均對(duì)酶活有不同程度的抑制作用，說明本試驗(yàn)中的降解酶受在高金屬離子濃度的條件下受到負(fù)向調(diào)控。

在本試驗(yàn)中，離心上清液作為篩選菌株降解AFB1的主要場所，其降解能力較易受到溫度、pH和金屬離子的影響，而這與功能性蛋白的特性十分相近，因此判斷本試驗(yàn)的篩選菌株是通過向發(fā)酵液中分泌胞外酶的途徑來降解AFB1的。

在本試驗(yàn)中，活菌對(duì)照組對(duì)AFB1的降解能力高于其它各處理組之和，綜合以上研究推測，原因可能是篩選菌株將一部分降解后的AFB1產(chǎn)物吸收到菌體內(nèi)作為其生命活動(dòng)的碳來源，而降解產(chǎn)物的減少又催化胞外降解酶降解了更多的AFB1底物，而在單獨(dú)使用發(fā)酵上清液處理AFB1時(shí)，由于缺少了活菌對(duì)降解產(chǎn)物的代謝，使酶解反應(yīng)更容易達(dá)到平衡，造成其降解能力低于活菌對(duì)照組。因此，在未來的試驗(yàn)中，如何建設(shè)AFB1的酶解產(chǎn)物，進(jìn)一步增加其降解率，是除了發(fā)酵降解條件優(yōu)化外，提高本試驗(yàn)中篩選菌株降解AFB1的另外一個(gè)有效的研究方向。

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Study on the Effect Factors of Degradation of Aflatoxin B1by Aspergillus Niger

CHEN Zhi-hui1，XU Xin2，LI Zhong-yu1，CHENG Bao-jing1，*
（1.College of Animal Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161000，Heilongjiang，China）

Aflatoxin B1（AFB1），as a kind of mycotoxin produced by Aspergillus spp.，was a highly toxic substance and widely distributed in food matrix.Microbiological was major research method of the degradation of AFB1.The study use screened Aspergillus niger which can degrade AFB1，through different treatment of fermentation broth，thermal stability，pH stability，and the stability of the metal ions of the fermentation broth，to research the effect factors of AFB1degradation.Through its fermentation broth different handling methods and different conditions of its degradation of AFB1ability of research，initially determine the screening strains by metabolism and secretion of extracellular enzymes to degrade AFB1，while the secretion of extracellular enzymes is main means of AFB1degradation.

Aflatoxin B1；degradation；Aspergillus niger；effect factors

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.028

2013-12-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.31072046）；現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)體現(xiàn)項(xiàng)目（CARS-36）

陳志輝（1980—），男（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)。