金花茶黃酮類成分超聲輔助半仿生提取工藝研究

牛廣俊，朱　思，王維華，陳清英，魏藝聰，梁一池，*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122；2.漳平市展宏金花茶專業(yè)合作社，福建漳平364400）

金花茶黃酮類成分超聲輔助半仿生提取工藝研究

牛廣俊1，朱思1，王維華1，陳清英2，魏藝聰1，梁一池1，*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122；2.漳平市展宏金花茶專業(yè)合作社，福建漳平364400）

以金花茶花為研究對象，用浸膏得率（HE）、總黃酮得率（TFA）、指紋圖譜共有峰HPLC總面積（S）、提取液中蘆丁的含量（VP）、提取液的抗氧化活性等作為衡量提取工藝的指標，采用均勻設(shè)計、指紋圖譜、抗氧化活性實驗優(yōu)選金花茶半仿生提取法的條件。利用DPS分析軟件得到二次多項式逐步回歸方程的預(yù)測模型，結(jié)合工業(yè)實際生產(chǎn)，確定最佳提取條件為：3次提取用70%乙醇的pH依次為4.5、6.5、8，提取時間依次為10、5、5min。在此條件下，浸膏得率為38.50%，總黃酮得率為135.05mg/g，蘆丁為3.46mg/g，指紋圖譜共有峰HPLC總面積為33082.15，ABTS+自由基消除率為60.50%，DPPH自由基消除率為78.05%，標準化得分值為59.96，與理論值60.49的相對誤差為0.88%。說明金花茶采用半仿生提取可行，均勻設(shè)計優(yōu)選的條件的相關(guān)參數(shù)效果較好，得出的回歸方程具有一定的實踐指導(dǎo)意義。

金花茶，均勻設(shè)計，半仿生提取，HPLC指紋圖譜，抗氧化作用

金花茶［Camellia chrysantha（Hu）Tuyama］是山茶科山茶屬金花茶組植物，主要分布在廣西省和福建省部分地區(qū)，其花可作為茶飲用，稱為“金花茶”。隨著近幾年保健品及涼茶等的不斷開發(fā)與上市，金花茶作為傳統(tǒng)的藥、茶兩用佳品，其市場需求量猛增［1］。為保證金花茶保健產(chǎn)品的品質(zhì)，其有效成分的提取研究就顯得頗有意義。

半仿生提取（SBE）是根據(jù)中藥藥效物質(zhì)部分已知而大部分未知的現(xiàn)實情況，從生物藥劑學(xué)的角度為經(jīng)消化道給藥的中藥及其復(fù)方制劑創(chuàng)立的一種提取技術(shù)［2］。但是半仿生提取多用煎煮法，存在煎煮時間長，能源消耗高的缺點。超聲法能利用空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機械振動等作用促進提取的進行［3］。本實驗根據(jù)SBE法理論［4］，綜合以上2種提取方法，以金花茶花（簡稱“金花茶”）為研究對象，采用均勻設(shè)計法［5］優(yōu)化其半仿生超聲提取工藝，為得到高品質(zhì)的金花茶提取液提供一定的技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

金花茶由漳平市展宏金花茶專業(yè)合作社提供；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2′-聯(lián)氮-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+） Sigma-Aldrich公司；蘆丁成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇色譜純；水超純水；其他試劑均為分析純。

Waters e2695型高效液相色譜儀（HPLC）包括四元泵，在線脫氣機，自動進樣器，柱溫箱，2998 PDA檢測器，Empower 3工作站，美國Waters公司；Ultimate XB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；UV-9100紫外-可見分光光度計北京瑞利分析儀器公司；PB-10標準型pH計德國賽多利斯集團；AR2130電子天平上海奧豪斯儀器有限公司；THC-10B數(shù)控超聲波提取器濟寧天華超聲電子儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Millipore超純水機法國Millipore公司。

1.2實驗方法

1.2.1金花茶提取工藝流程金花茶→干燥（自然風(fēng)干）→粉碎（60目）取1.0g→70%乙醇超聲輔助半仿生提取3次→濃縮濾液→70%乙醇定容到10mL→金花茶提取液

1.2.2實驗設(shè)計依據(jù)半仿生提取法理論，采用U9（91×33）均勻設(shè)計，以干浸膏得率（HE）、提取液中總黃酮（TFA）的得率、提取液中蘆丁（VP）含量、指紋圖譜共有峰HPLC總面積（S）、提取液對ABTS+自由基消除率（SC）和DPPH自由基消除率（SH）為指標，固定提取功率為500W、40kHz，考察3次提取液的pH及提取時間對提取效果的影響。提取3次，3次提取液的用量分別為藥材質(zhì)量的10、8、8倍。pH按表1安排，3次提取時間比例為2∶1∶1，得1～9號提取液，重復(fù)3次，以考察重復(fù)性。

表1　U9（91×33）均勻設(shè)計Table 1　U9（91×33）uniform design

1.2.3干浸膏得率的測定1.2.2中得到1～9號提取液，分別為10mL。精密吸取1～9號提取液各5mL，分別置于已烘至恒重的蒸發(fā)皿中（105℃恒重2h），蒸發(fā)溶劑至微量水分后，移入55℃恒溫干燥箱恒重12h后，置于干燥器內(nèi)30min，稱定質(zhì)量并按下式計算干浸膏得率（HE）。

HE（%）=2W/m×100

其中，W：干浸膏質(zhì)量；m：金花茶質(zhì)量；2：換算后系數(shù)。

1.2.4總黃酮得率的測定

1.2.4.1總黃酮標準曲線的制作精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品5mg，于10mL量瓶中，加70%乙醇溶解，稀釋至刻度，搖勻備用。移取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL于10mL量瓶中，參考文獻［6］，采用硝酸鈉-硝酸鋁法顯色，于510nm波長處測定吸光度。以對照品溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。

1.2.4.2提取液中總黃酮含量的測定精密移取1～9號提取液1.0mL置于10mL容量瓶中，70%乙醇定容至刻度，得供試品溶液。按1.2.4.1項下方法顯色，測定吸光度，根據(jù)蘆丁標準曲線方程計算提取液中總黃酮的含量。

1.2.4.3總黃酮得率的計算按下式計算總黃酮的得率。

總黃酮得率（mg/g）=提取液中總黃酮質(zhì)量/原料的總質(zhì)量。

1.2.5提取液中蘆丁的含量測定

1.2.5.1溶液的制備精密稱定蘆丁對照品適量，用70%乙醇配制濃度為0.804mg/mL的對照品溶液。

1.2.5.2色譜條件Ultimate XB-C18色譜柱（4.6mm× 250mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；梯度洗脫：0～20min，35%A；20～30min，55%A；30～70min，55%A；流速0.8mL/mL，檢測波長360nm，柱溫30℃，進樣量20μL。

1.2.5.3標準曲線的繪制配制濃度分別為0.804、0.603、0.402、0.201、0.080、0.040mg/mL的蘆丁對照品溶液，按1.2.5.2項下色譜條件進樣。以峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。

1.2.5.4提取液中蘆丁含量測定1～9號提取液經(jīng)0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，得供試品溶液。按上述色譜條件，分別測定1～9號提取液中蘆丁的含量。

1.2.6指紋圖譜的建立利用Empower 3工作站對9個金花茶的半仿生提取液的指紋圖譜進行重疊，采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》，通過色譜峰多點校正的方法對9個金花茶半仿生提取液的指紋圖譜色譜峰進行自動匹配，得出9個金花茶的相似度計算結(jié)果。

1.2.7提取液抗氧化能力測定精密移取1.2.1項下金花茶提取液1.0mL于50mL量瓶中，定容至刻度，得生藥濃度為2mg/mL供試品溶液。參考文獻［7］，以DL-α-生育酚（0.218mg/mL）為陽性對照藥物，分別采用ABTS+自由基法和DPPH自由基法測定提取液的抗氧化能力。

1.2.8綜合評分由于各提取物的評價指標不同，故采用綜合評分法［8］，共計60分，對各提取物的品質(zhì)進行綜合評價。

1.2.9驗證性實驗采用DPS（V7.05）軟件進行數(shù)據(jù)分析，得出最佳提取條件。按照優(yōu)化所得工藝條件，制備3批樣品，分別對各指標進行測定考察。

2　結(jié)果與分析

2.1回歸方程與線性范圍

表2　總黃酮、蘆丁回歸方程和線性范圍Table 2　Regression equation and linear range of total flavonoids and rutin

表2結(jié)果表明，總黃酮和蘆丁的標準曲線在各自的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2不同工藝下金花茶各指標含量及評分值

按上述方法，對金花茶不同工藝下提取液中化學(xué)成分進行含量與抗氧化活性的測定，并按1.2.8項下公式計算，得金花茶超聲輔助半仿生提取綜合評分值，結(jié)果見表3。通過R值可直觀發(fā)現(xiàn)，不同工藝下金花茶的提取液的化學(xué)成分含量、抗氧化活性及評分值均有差異。不同工藝下金花茶的提取液對ABTS+自由基的影響較小，對DPPH自由基清除能力存在較大差異，說明不同提取條件不僅影響金花茶化學(xué)成分的溶出，而且影響金花茶的抗氧化能力。分析原因可能是金花茶中主要含有黃酮類和多酚類化合物，有較多的酚羥基，提取液的pH會影響其活性成分的解離狀態(tài)，從而影響活性成分的溶出。

表3　金花茶半仿生提取工藝指標結(jié)果Table 3　Results of semi bionic extraction of Camellia chrysantha

圖1　金花茶半仿生1號提取液的HPLC色譜圖Fig.1　HPLC of No.1 semi bionic extraction of Camellia chrysantha

圖2　金花茶半仿生提取液指紋圖譜的重疊圖Fig.2　Overlapping chromatograms of solution by semi bionic extraction for Camellia chrysantha

表4　9個金花茶半仿生提取HPLC指紋圖譜相似度Table 4　Similarity of HPLC of semi bionic extraction of Camellia chrysantha

2.3相似度計算結(jié)果

利用Empower 3工作站對9個金花茶的半仿生提取液的指紋圖譜進行處理，得圖1～圖2，4號峰為蘆丁，其他峰均為主要的未知共有峰。經(jīng)國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》分析，得到金花茶半仿生提取液的相似度計算結(jié)果，見表4。結(jié)果表明，金花茶半仿生提取工藝所得提取液之間有良好的相似度，均在0.9以上。說明其化學(xué)成分組成基本上一致，僅化學(xué)成分的含量之間存在差異。不同工藝下的半仿生提取不會改變金花茶的活性成分，主要影響有效成分的溶出，符合穩(wěn)定、可控的要求。

2.4優(yōu)選提取工藝

將表3中綜合評分值結(jié)果輸入均勻設(shè)計軟件DPS（V7.05）進行二次多項式逐步回歸分析，得回歸方程：Y=64.12+6.45A－2.10B－0.92A2+0.04AD－0.03CD（R2=0.93，p＜0.05）。確定最佳提取條件為A=4.289、B= 6.500、C=8.2199、D=20.14，此時理論綜合得分值為60.4893。結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)實際，確定金花茶半仿生提取條件的三次提取pH依次為4.5、6.5、8，提取時間依次為10、5、5min。

2.5驗證性實驗

按照優(yōu)化所得工藝條件，制備3批樣品，分別對各指標進行測定考察。結(jié)果浸膏得率為38.50%，總黃酮得率為135.05mg/g，蘆丁為3.46mg/g，指紋圖譜共有峰HPLC總面積為33082.15，以DL-α-生育酚（0.218mg/mL）為陽性對照藥物，金花茶提取液的生藥濃度為2mg/mL，相同給藥體積下，金花茶提取液對ABTS+自由基、DPPH自由基消除率分別為60.50%、78.05%，綜合評分值（Y）為59.96，接近理論值，說明優(yōu)選條件可行。在此條件下，金花茶提取液對ABTS+自由基消除率的IC50為1.65mg/mL，對DPPH自由基消除率的IC50為1.27mg/mL。

3　結(jié)論

半仿生法可以提取和保留更多的有效成分，得到含藥理指標高的活性混合成分［9］，而超聲輔助能夠提高提取效率、省時，是一種行之有效的提取方法。研究結(jié)果表明，以不同pH的70%乙醇為提取溶劑，運用半仿生超聲提取法對金花茶黃酮類成分進行提取是可行的。通過均勻設(shè)計實驗得出金花茶半仿生提取條件的三次提取最佳pH依次為4.5、6.5、8，提取時間依次為10、5、5min。在此條件下，金花茶提取液綜合評分值為59.96。黃酮類物質(zhì)是金花茶中重要的活性成分，其提取工藝的研究為金花茶進一步的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of ultrasonic assisted semi-bionic extraction technology for Camellia chrysantha

NIU Guang-jun1，ZHU Si1，WANG Wei-hua1，CHEN Qing-ying2，WEI Yi-cong1，LIANG Yi-chi1，*
（1.Fujian University of Traditional Chinese Medicine（TCM），F(xiàn)uzhou 350122，China；2.Camellia Cooperatives of Zhan Hong，Zhangping 364400，China）

Camellia chrysantha as the research object，with the Hop extract（HE），total flavonoids（TFA），total HPLC integrate area of common peaks in fingerprints（S），the content of rutin（VP），antioxidant activity as a measure indicator.The uniform design，fingerprint，the antioxidant activity of experimental was used to optimize of semi bionic extraction conditions of Camellia chrysantha.Prediction model analysis software with two polynomial stepwise regression equation by DPS.According to industry production condition，the best technical condition:pH values of 70%ethanol for the 1st，2nd，and 3rd decoctions were in order of 4.5，6.5 and 8.0，and the extraction time were 10，5 and 5min，respectively.Under these conditions，the hop extract，total flavonoids，total HPLC integrate area of common peaks in fingerprints，the content of rutin，the elimination rate of ABTS+free radical and the elimination rate of DPPH free radical was 38.50%，135.05mg/g，3.46mg/g，33082.15，60.50% and 78.05%.Compared to the theoretical value，the relative error of 0.88%.Optimized by DPS regression equation derived some practical significance.

Camellia chrysantha；uniform design；semi-bionic extraction；HPLC fingerprint；antioxidant activity

TS255.1

B

1002-0306（2015）10-0241-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.042

2014－12－19

牛廣俊（1990-），男，碩士研究生，研究方向：中藥資源與品質(zhì)評價。

梁一池（1952-），男，教授，研究方向：中藥資源與品質(zhì)評價。

福建省教育廳項目（JA11138）；福建省龍巖市資助項目（201367）。