低檔綠茶多糖的酶法輔助提取及抗氧化活性研究

何曉梅，張　穎，許星云，史　珊，喬德亮

（1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安237012；2.植物細胞工程安徽省工程技術研究中心，安徽六安237012）

低檔綠茶多糖的酶法輔助提取及抗氧化活性研究

何曉梅1，2，張穎1，許星云1，史珊1，喬德亮1

（1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安237012；2.植物細胞工程安徽省工程技術研究中心，安徽六安237012）

以皖西低檔綠茶為原料，通過酶法輔助浸提茶多糖，然后對浸提液進行醇沉、真空干燥得粗多糖，比較三種不同方法對粗多糖脫蛋白效果，并研究茶多糖的體外抗氧化活性。結果表明：酶法輔助浸提的最優條件：料液比1∶30（g/mL）、酶解溫度45℃、酶解時間120min、纖維素酶添加量12mg/g，果膠酶添加量12mg/g、浸提1次，茶多糖得率達到5.414%。三氯乙酸法、sevage法、木瓜蛋白酶法對粗多糖中蛋白的最大脫除率分別為84.14%、69.45%、74.34%，多糖損失率分別為18.56%、24.01%、12.34%。相對而言，木瓜蛋白酶法條件溫和，更適合茶多糖脫蛋白。另外，茶多糖具有較強的還原能力以及對羥基自由基的清除能力，對亞硝基具有一定的清除作用。

茶多糖，纖維素酶，果膠酶，脫蛋白，抗氧化活性

皖西地區茶葉資源豐富，霍山、金寨、舒城、六安等地都是產茶大縣，茶葉是農村經濟的主導產業之一。其中名優茶產量只占茶葉總產量20%左右，占總產值的80%以上。夏秋茶和粗老茶滯銷，茶農的收入受到極大的影響。茶葉中的主要生理活性物質有茶多酚、茶多糖、茶氨酸、咖啡堿等，茶多糖是茶葉中繼茶多酚開發之后的又一熱點課題。茶多糖是一種酸性糖蛋白，并結合有大量的礦質元素，為水溶性復合物，易溶于熱水，不溶于高濃度的有機溶劑。目前，其功效的研究集中在降血糖［1-2］、降血脂［3］、抗氧化［4］、增強免疫力、治療心血管疾病等方面，近些年來發現茶多糖還具有治療糖尿病的功效［5］。研究表明，茶多糖在粗老茶中含量比嫩茶中含量高［6-7］。目前對皖西粗老低檔綠茶多糖的相關研究未見報道，若能從中提取茶多糖并進行相關研究，發掘其中的價值，對于皖西粗老茶葉的綜合利用具有極大的意義。

本實驗以皖西粗老低檔綠茶為原料，通過酶法輔助浸提茶多糖并進行純化，初步研究茶多糖的體外抗氧化活性，為皖西粗老綠茶的深度開發提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

低檔綠茶市售；酶制劑：纖維素酶（≥30U/mg）、果膠酶（30U/mg）、木瓜蛋白酶（20U/mg）Ruibio分裝；葡萄糖標準品（≥98%） 貴州迪大科技有限責任公司；亞硝酸鈉標準品北京萊耀生物科技有限公司；牛血清白蛋白上海生工生物工程有限公司；考馬斯亮藍G250、重蒸酚、石油醚、無水乙醇、三氯乙酸、氯仿、正丁醇、濃硫酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、水楊酸、過氧化氫、鄰苯三酚等試劑均為分析純；水蒸餾水。

FA1004B電子分析天平新芝生物科技有限公司；HH-S4數顯控溫水浴鍋金壇市華龍實驗儀器廠；DHG-9420B上?，槴{智能型電熱恒溫鼓風干燥箱上海嘉措儀器設備有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；SY-2000型旋轉蒸發器、SHZ－D（Ⅲ）型循環水真空泵上海亞榮生化儀器廠；GL-21M高速冷凍離心機湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；VD23真空干燥箱上海摩億科貿有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1茶葉的預處理將新鮮的低檔茶葉除梗，粉碎，過篩得30～60目的粉末，用石油醚索氏提取2h，40℃烘干；再用70%乙醇于70℃浸提2h，抽濾，40℃烘干，保存進行后續實驗。

1.2.2茶葉粗多糖的提取準確稱取一定質量的預處理茶葉粉末，按照一定的水茶比加入蒸餾水和一定質量分數的酶，于一定溫度下水浴提取一定時間后，升溫滅酶活10min，抽濾，離心得濾液，取出部分濾液測定浸提液中茶多糖含量，剩余濾液減壓濃縮為原體積的1/4，然后向濃縮液中加入95%的乙醇至乙醇終濃度為80%［8］，4℃過夜，離心，收集沉淀，真空干燥得粗多糖。

1.2.2.1單因素實驗纖維素酶添加量的確定：分別準確稱取5.000g經預處理的茶葉粉末21份，按0、2、4、6、8、10、12、14mg/g的量加入纖維素酶（每個水平3個平行實驗），在料液比1∶30、酶解溫度50℃下酶解120min，升溫滅酶活10min，抽濾，離心得濾液，進行后續實驗。

果膠酶添加量的確定：在纖維素酶添加量確定的基礎上取樣，按0、2、4、6、8、10、12、14mg/g的量加入果膠酶酶解浸提，確定果膠酶加入量。

酶解時間的確定：在纖維素酶加入量和果膠酶加入量確定的基礎上取樣，分別酶解提取40、60、80、100、120、140min，以確定酶解時間。

酶解溫度的確定：在纖維素酶加入量、果膠酶加入量和酶解時間確定的基礎上取樣，分別于35、40、45、50、55℃下酶解提取，以確定酶解溫度。

1.2.2.2正交實驗在1.2.2.1單因素實驗的基礎上，以纖維素酶添加量（A）、果膠酶添加量（B）、酶解時間（C）和酶解溫度（D）為考察對象，以茶多糖得率為考察指標，設計L9（34）正交實驗（見表1），確定酶法輔助浸提茶多糖的最佳工藝條件。

表1　正交實驗水平表Table 1　Orthogonal experiment level table

1.2.3茶葉粗多糖脫蛋白

1.2.3.1三氯乙酸法脫蛋白精確量取7份茶多糖溶液10mL，分別加入三氯乙酸晶體0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07g，快速混勻，4℃靜置過夜，然后按照5000r/min離心10min，丟棄沉淀，收集上清液，再次將其定容至10mL的容量瓶中，測定多糖的含量及蛋白質含量。

1.2.3.2sevag法脫蛋白［9］將粗多糖研磨，用適量蒸餾水溶解，精確量取茶多糖樣品液30mL，sevage試劑（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1）6mL，劇烈振搖30min，再在5000r/min的條件下離心10min，去除下層和沉淀部分，測定上清液中的多糖和蛋白質含量。上清液按上述方法繼續進行第二次脫蛋白，測定多糖與蛋白質含量。如此重復上述步驟，脫蛋白進行第三次、第四次、第五次、第六次，分別測定其上清液中多糖與蛋白質含量。

1.2.3.3木瓜蛋白酶法脫蛋白［10］精確量取6份10mL多糖樣品液于錐形瓶中，調節其pH至6.0，再分別向其中加入濃度為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%的木瓜蛋白酶液10mL，將混合液于55℃的水浴鍋中保溫1.5h，然后于沸水浴中5min滅酶活，5000r/min離心10min，除去沉淀，得脫蛋白液，分別測定其中的多糖含量及蛋白質含量。

1.2.4精制茶多糖的體外活性研究將脫蛋白的多糖溶液透析，減壓濃縮，加入95%乙醇醇沉過夜，離心，真空干燥得精制茶多糖。

1.2.4.1茶多糖還原力的測定根據文獻［11］，多糖還原力的測定采用普魯士藍法，量取1.0mL濃度為40、80、120、160、200μg/mL的多糖溶液于5支試管中，依次加入2.5mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5mL 1.0%的鐵氰化鉀溶液，混勻后置于50℃水浴20min，然后加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻，反應30min后，4000r/min離心10min。各移取2.5mL上清液于另一試管中，加入2.5mL蒸餾水及0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻，靜置10min后，測定OD700nm。以VC作陽性對照。

1.2.4.2茶多糖對亞硝基（NO2-）清除能力的測定根據文獻［12-13］，茶多糖對NO2-清除能力的測定采用鹽酸萘乙二胺比色法。分別準確吸取1mL濃度為40、80、120、160、200μg/mL的多糖溶液于5支具塞試管中，加入2mL 10μg/mL的NaNO2標準溶液、2mL pH3.0的檸檬酸緩沖液，搖勻后于37℃水浴中保溫1h。取出后加入2mL 4g/L對氨基苯磺酸，搖勻靜置5min，再加入lmL 2g/L鹽酸萘乙二胺，混勻靜置15min，以VC作陽性對照，測定550nm處吸光度。

NO2-清除率（%）=［（A0-A）/A0］×100

式中：A0為空白對照吸光值；A為不同濃度反應液（茶多糖或VC）吸光值。

1.2.4.3羥基自由基（·OH）清除能力的測定根據文獻［14］，采用Fenton反應法測定茶多糖對·OH的清除能力。取編號的試管6支，依次分別加入1.0mL 6mmol/L FeSO4、2.0mL 6mmol/L水楊酸溶液和2.0mL濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的茶多糖溶液，最后加入2.0mL 6mmol/L H2O2室溫下反應1h，測定510nm處吸光度，計算清除率。其中以蒸餾水為空白對照，以VC作陽性對照。

清除率（%）=（A0-A）/A0×100

式中：A0為空白對照液的吸光度；A為加入茶多糖或VC溶液后的吸光度。

1.2.5茶多糖及蛋白質含量的測定茶多糖含量測定采用苯酚-硫酸法。根據吸光度值（0.2～0.8）與濃度值（＜100μg/mL）線性關系良好，以減小濃度的相對誤差，提高測定的準確度，對文獻［15］葡萄糖標準液濃度取值范圍略有修改，其葡萄糖標準曲線方程為：y= 0.016x-0.018，R2=0.9995。

茶多糖得率（%）［15］=［（C樣品×提取液總體積×換算因子）/（茶樣質量×103）］×100

多糖損失率（%）=（脫蛋白前茶多糖含量-脫蛋白后茶多糖含量）/脫蛋白前茶多糖含量×100

蛋白質含量測定采用Bradford法，以牛血清蛋白做標準曲線。其標準曲線方程為：y=0.1646x-0.1739，R2=0.9992，蛋白質濃度在10～100μg/mL范圍內線性關系良好。

蛋白脫除率（%）=（脫蛋白前蛋白質含量-脫蛋白后蛋白質含量）/脫蛋白前蛋白質含量×100

2　結果與分析

2.1酶法輔助浸提單因素實驗

2.1.1單一酶添加量對茶多糖得率的影響纖維素酶催化纖維素分解，果膠酶分解果膠質，從而破壞茶葉細胞壁，使茶葉內的成分更容易溶解、擴散。由圖1可知，在酶實驗添加量范圍內，多糖的得率隨著酶添加量的增加而增加。纖維素酶添加量從6～10mg/g時茶多糖的得率增加比較明顯，但增加幅度比較平緩。果膠酶添加量從4～10mg/g時茶多糖的得率增加比較明顯。兩者都是隨著酶濃度的增加茶多糖得率趨于穩定?？赡茉蚴敲噶窟^高，底物濃度不能對酶達到飽和，致使酶的作用受到抑制［16］。另外，相比于果膠酶，纖維素酶的加入對茶多糖得率影響大些。

2.1.2單一酶酶解時間對茶多糖得率的影響由圖2可知，茶多糖的得率隨酶解時間的增加而增加。酶解時間在40～60min時，茶多糖得率低且增加不明顯，可能原因是茶葉粉末仍處于溶脹階段；在60～120min時茶多糖得率增加明顯；酶解時間達到120min后茶多糖得率增加不明顯。長時間的浸提往往導致大量雜質溶出，另外耗費能源也越多，故采用酶解時間120min。

圖1　酶添加量對茶多糖得率的影響Fig.1　Effect of enzymolysis concentration on extraction of tea polysaccharide

圖2　酶解時間對茶多糖得率的影響Fig.2　Effect of enzymolysis time on extraction of tea polysaccharide

2.1.3單一酶酶解溫度對茶多糖得率的影響由圖3可知，在35～55℃范圍內，對于纖維素酶和果膠酶，隨酶解溫度的升高，茶多糖得率呈現出先增加后下降的趨勢，酶解溫度為45℃時，茶多糖的得率達到最高，與文獻［17］結果一致。這是由于開始隨溫度升高，酶反應速度加快，茶多糖得率增加，之后隨溫度進一步升高，引起酶蛋白變性，酶活力降低，茶多糖得率降低。

圖3　酶解溫度對茶多糖得率的影響Fig.3　Effect of enzymolysis temperature on extraction of tea polysaccharide

2.1.4正交實驗優化茶多糖提取工藝按照表1的因素水平，進行四因素三水平正交實驗L9（34），正交實驗結果和極差分析見表2。由表2可知，各因素對綠茶粗多糖得率影響主次順序為：A＞C＞B＞D，即酶解溫度對綠茶粗多糖得率影響最大，依次是纖維素酶添加量，酶解時間，果膠酶添加量影響最小。雙酶作用下的得率比單酶作用下的得率有了明顯的提高，茶多糖提取的最佳工藝組合為A2B2C3D3，即酶解溫度45℃，酶解時間120min，纖維素酶添加量12mg/g，果膠酶添加量12mg/g。在此條件下進行茶多糖提取的驗證實驗，3組平行實驗的結果分別是5.415%、5.420%、5.408%，平均得率為5.414%。

表2　正交實驗設計及方差分析Table 2　Design and results of orthogonal experiment

2.2粗多糖不同脫蛋白方法比較

2.2.1三氯乙酸法脫蛋白效果由圖4可知，三氯乙酸添加量小于3×10-3g/mL時，其蛋白脫除率上升速度極快，特別是在添加量為（2～3）×10-3g/mL之間。當三氯乙酸添加量為3‰時其對粗多糖蛋白脫除率達到78.02%，多糖損失率為9.45%。當大于3×10-3g/mL時，蛋白脫除率幾乎處于平穩趨勢，三氯乙酸添加量對蛋白的去除效果不明顯；然而隨著三氯乙酸添加量的增大，多糖損失率呈緩慢平穩上升趨勢。三氯乙酸添加量達到7‰時，其對蛋白的脫除率為84.14%，其多糖損失率為18.56%。三氯乙酸與蛋白質形成不可逆沉淀，反應較為劇烈，濃度過高，多糖結構也有可能被破壞［18］，繼而影響其活性。

圖4　TCA法脫蛋白效果Fig.4　Results of removal of protein from trichloroacetic acid method

2.2.2sevage法脫蛋白效果sevage法是根據蛋白質在三氯甲烷溶劑中變性的特點來脫除蛋白的。由圖5可知，使用sevage法1次后其蛋白脫除率高達32.71%，多糖損失率為9.31%。第5次脫蛋白率達68.23%，多糖損失率達22.34%。其后，其脫蛋白效果不再呈現優勢，逐漸趨于平穩態。第7次蛋白脫除率為69.45%，而多糖損失率高達24.01%。與三氯乙酸法比較，三氯甲烷有毒，且其脫蛋白效果不及三氯乙酸，多糖損失率相對較高。

圖5　Sevage法脫蛋白效果Fig.5　Results of removal of protein from sevage

2.2.3木瓜蛋白酶法脫蛋白效果由圖6可知，隨著酶添加量的逐漸增加，蛋白質脫除率及茶多糖的損失率都在逐漸增大。當酶添加量小于5‰時，每增加一梯度，蛋白質脫除率變化都比較明顯，尤其是（2.5～5.0）×10-3g/mL之間。在5.0×10-3g/mL酶添加量的情況下，其蛋白脫除率高達74.34%，多糖損失率為12.34%。當酶添加量大于5.0×10-3g/mL后，蛋白脫除率變化呈現平穩趨勢。相比與三氯乙酸法和Sevag法，酶法脫蛋白率高，多糖損失率低，無污染。

圖6　木瓜蛋白酶法脫蛋白效果Fig.6　Protein removal effect of papain method

2.3茶葉多糖的體外活性檢測

比較3種不同方法脫蛋白效果，選取木瓜蛋白酶法脫蛋白液透析，濃縮，醇沉，離心，真空干燥（40℃）制得精制茶多糖。

2.3.1茶葉多糖還原力的測定普魯士藍法測定原理表明：吸光度與多糖還原能力成正比。根據1.2.4.1方法，茶多糖和VC還原力測定結果如表3。

表3　茶多糖和VC還原力的測定Table 3　Determination of reducing power of tea polysaccharide and VC

由表3可以看出，隨著茶葉多糖濃度的增加，其還原力逐漸加強。茶葉多糖濃度在120～160μg/mL時，其還原力與50μg/mL的抗壞血酸還原力相當。

2.3.2茶葉多糖對亞硝基的清除作用人或動物攝取的食物中含有或多或少的亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在酸性環境（人或動物的胃）中容易合成亞硝胺，亞硝胺是一類化學致癌物，清除亞硝酸鹽是減少致癌的有效途徑［19］。茶葉多糖對NO2-的清除作用見圖7，在實驗濃度范圍內，隨著茶多糖濃度的增加，其清除NO2-的能力逐漸增強，但比同濃度VC的清除作用弱。

圖7　茶多糖和VC對NO2-的清除作用Fig.7　Scavenging effect of tea polysaccharides and VCon NO2-

2.3.3茶葉多糖對羥基自由基（·OH）的清除能力由圖8可知，茶多糖對羥自由基具有較好的清除作用，濃度達到0.2mg/mL時，其清除率達到約75%，其后基本保持不變，而VC濃度達到0.6mg/mL時，其清除率達到約75%。雖然隨著濃度的增加，茶多糖對·OH的清除率低于VC，但較其他天然提取物仍具有優勢［20-21］。

圖8　茶多糖和VC對·OH的清除作用Fig.8　Scavenging effect of tea polysaccharides and VCon·OH

3　結論

3.1以皖西粗老低檔綠茶為原料，通過單因素和正交實驗，確定酶輔助浸提茶多糖的最佳工藝條件為：酶解溫度45℃，酶解時間120min，纖維素酶添加量12mg/g，果膠酶添加量12mg/g，茶水比1∶30（g/mL），浸提1次，茶多糖得率達到5.414%。

3.2比較三氯乙酸法、sevage法、木瓜蛋白酶法對粗多糖脫蛋白效果：木瓜蛋白酶法更適合茶多糖脫蛋白，條件溫和，蛋白脫除率高，且多糖損失率低。

3.3茶多糖體外抗氧化活性表明：其具有較強的還原能力以及對羥基自由基的清除能力，對亞硝基具有一定的清除作用。

［1］陳建國.茶多糖的提取及其藥理作用研究概況［J］.中草藥，2000，31（7）：6-7.

［2］陳萍，朱麗云，金暉.茶多糖的分離制備及其對ALX模型小鼠的降糖作用研究［J］.食品科技，2013，38（5）：194-196.

［3］韋璐，秦小明，林華娟，等.金花茶多糖的降血脂功能研究［J］.食品科技，2008（7）：247-249.

［4］聶少平，謝明勇，羅珍.茶葉多糖的抗氧化活性研究［J］.天然產物研究與開發，2005，17（5）：549-552.

［5］潘見，陳彥，方偉，等.具有抗氧化活性茶多糖TPS-Ⅱ的分離純化及其性質研究［J］.食品科學，2009，30（3）：25-28.

［6］陳建國，胡欣，梅松.茶葉中茶多糖的提取和測定方法［J］.中國衛生檢驗雜志，2004，14（4）：432-433.

［7］汪東風，謝曉鳳，王澤農，等.粗老茶中的多糖含量及其保健作用［J］.茶葉科學，1994，14（1）：73-74.

［8］陳義勇，竇祥龍，黃友如，等.響應面法優化超聲-微波協同輔助提取茶多糖工藝［J］.食品科學，2012，33（4）：100-103.

［9］王傳名，董祺，管從勝.日照綠茶粗多糖脫蛋白工藝研究［J］.食品工業科技，2010，31（8）：274-276.

［10］梁軍，夏永剛，楊炳有.麻黃多糖中蛋白含量測定及脫蛋白方法的比較［J］.中醫藥學報，2011，39（2）：73-75.

［11］陳欣，龔蘭，劉冠卉.食用真菌多糖提取條件的優化及其還原力的比較［J］.食品科學，2010，31（14）：140-144.

［12］李莉梅，李恒，朱苗，等.野生仙人掌多糖對DPPH·、NO2-的清除能力及其還原力研究［J］.廣東農業科學，2013（15）：121-123.

［13］陳莉華，龍進國，譚林艷，等.紅果參多糖的提取純化及抗氧化活性研究［J］.天然產物研究與開發，2013（25）：170-173.

［14］周向軍，高義霞，袁毅君.烏龍茶多糖提取工藝及抗氧化作用研究［J］.中國釀造，2011（8）：80-84.

［15］何曉梅，沈濤濤，陳壯壯，等.響應面法優化皖西粗老綠茶茶多糖提取工藝［J］.皖西學院學報，2014，30（2）：76-79.

［16］程雅芳，楊洋，溫富雄.響應面分析法優化酶提取甜茶茶多酚工藝［J］.食品科學，2012，33（10）：10-15.

［17］楊蓉生，陳煉紅，唐俊妮，等.復合酶法提取紅雪茶粗多糖工藝優化研究［J］.食品工業科技，2012，33（12）：285-288.

［18］朱美靜，童群義.猴頭多糖脫蛋白方法的研究［J］.河南工業大學學報：自然科學版，2005，26（4）：25-27.

［19］李佳穎，韓照祥，顧宏新.洋蔥提取液對亞硝酸鹽清除作用的研究［J］.化學工程與裝備，2012（4）：25-27.

［20］李朝陽，劉魁，韓忠宵，等.大蒜多糖的酶法提取及其抗氧化性研究［J］.食品科學，2008，29（1）：117-120.

［21］徐勝龍，楊建雄.柿子醇提取物的體外抗氧化研究［J］.食品科學，2008，29（4）：131-134.

Enzymatic-assisted extraction process and antioxidant activities of tea polysaccharide from low quality green tea

HE Xiao-mei1，2，ZHANG Ying1，XU Xing-yun1，SHI Shan1，QIAO De-liang1
（1.College of Biology and Pharmaceutical Engineering，West Anhui University，Liu’an 237012，China；2.Engineering Technology Research Center of Plant Cell Engineering，Liu’an 237012，China）

Low quality green tea as material and enzymatic extraction as assisted method for extraction，the research extracted alcohol precipitation，vacuum dried crude tea polysaccharides，and compared the three methods of removing protein from crude tea polysaccharides，as well as studied vitro antioxidant activities of the tea polysaccharides.The result showed that optimal conditions of enzymatic assisted extraction:ratio for water and material was 1∶30（g/mL），enzymatic temperature 45℃，enzymatic time 120min，cellulose enzyme loadings 12mg/g，pectinase loadings 12mg/g，and extraction time once.Tea polysaccharides extraction ratio could be 5.414%.Maximum removal rate for crude polysaccharides deproteinization through trichloroacetic acid method，sevage method，and papain method was 84.14%，69.45%，and 74.34%respectively.Polysaccharides loss rate was 18.56%，24.01%，and 12.34%respectively.Comparatively papain method was with a mild condition and best fits for tea polysaccharides deproteinization.In addition，tea polysaccharides had better reducing capacity and free radical scavenging ability of·OH，as well as certain reducing ability to NO2-.

tea polysaccharides；cellulose enzyme；pectinase；deproteinization；vitro antioxidant activities

TS272

A

1002-0306（2015）10-0153-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.023

2014-06-06

何曉梅（1974-），女，碩士研究生，講師，研究方向：天然產物研究與開發。

安徽省自然科學基金項目（KJ2013B341）；省級大學生創新創業項目（AH201310376027）；國家自然科學基金項目（31271853）；六安市定向委托項目（2012LWA011）；皖西學院黨建創新活動項目（WXXYDJ12003）；皖西學院“生物質煉制”科技創新平臺項目（004013010）。