新疆喀什地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸乳中乳酸菌多樣性的初步分析

袁雪林，楊　潔，胡　敏，焦　琳

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

新疆喀什地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸乳中乳酸菌多樣性的初步分析

袁雪林，楊潔*，胡敏，焦琳

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

為了對(duì)采自喀什地區(qū)的22個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵酸乳樣品的多樣性進(jìn)行研究，采用免培技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，PCR-DGGE）結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法對(duì)22個(gè)酸乳樣品進(jìn)行研究。結(jié)果表明：用傳統(tǒng)方法分離得到7種乳酸菌，其中德氏乳桿菌（L.delbrueckii subsp）為優(yōu)勢(shì)菌群。對(duì)采用PCR-DGGE方法得到的4條條帶進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明瑞士乳桿菌（Lactobacillus.helveticus）的豐度最高，是酸乳樣品中的優(yōu)勢(shì)菌群，次優(yōu)勢(shì)菌分別為德氏乳桿菌（Lactobacillus.delbrueckii subsp）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）。傳統(tǒng)分離法與PCR-DGGE技術(shù)結(jié)合能夠更有效、更全面地分析傳統(tǒng)乳制品中微生物的多樣性及優(yōu)勢(shì)菌。

變性梯度凝膠電泳，乳酸菌，優(yōu)勢(shì)菌

新疆是我國(guó)重要的牧業(yè)基地，自然環(huán)境和氣候差異很大。各少數(shù)民族長(zhǎng)久以來(lái)習(xí)慣制作傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶作為日常飲品，其中主導(dǎo)發(fā)酵的乳酸菌群也因地域、氣候及制作習(xí)慣等原因具有明顯的差異性，乳酸菌資源的生物多樣性和基因多樣性是其他國(guó)家和地區(qū)所沒(méi)有的［1］。近些年來(lái)，隨著酸奶工業(yè)的飛速發(fā)展，對(duì)于菌種資源的保護(hù)和利用也得到了越來(lái)越多的重視。

發(fā)酵食品中微生物多樣性的分析方法主要有免培養(yǎng)和培養(yǎng)兩種技術(shù)。傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法工作量大，操作繁瑣，且自然環(huán)境中存在大量不可培養(yǎng)的微生物，因此傳統(tǒng)培養(yǎng)不能完全鑒定出環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)［2-3］。Fischer和Lerman等［4］最先提出變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)，并用于DNA突變的檢測(cè)。Muyzer等［5］首次把DGGE技術(shù)用于微生物菌落和生物膜系統(tǒng)的菌落多樣性研究，并證實(shí)了這種技術(shù)在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異性方面的優(yōu)越性。董曉婉等［6］利用PCR-DGGE對(duì)新疆傳統(tǒng)酸乳制品中乳酸菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)和序列分析進(jìn)行了驗(yàn)證，快速準(zhǔn)確的確定了樣品中乳酸菌的群落結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢(shì)菌。DGGE技術(shù)既可用于傳統(tǒng)發(fā)酵制品中微生物群落結(jié)構(gòu)的分析，也可對(duì)已分離純化的菌株分組和篩選，與瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，具有分辨精度高，可快速準(zhǔn)確地鑒定自然環(huán)境或人工環(huán)境中微生物種群，分析復(fù)雜微生物群落的結(jié)構(gòu)演替規(guī)律等優(yōu)點(diǎn)［7］。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于微生物分子生物學(xué)的各個(gè)研究方向，已成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一［8］。

目前，傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌的群落結(jié)構(gòu)分析主要通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)或現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，但結(jié)合兩種方法對(duì)新疆傳統(tǒng)酸乳制品中乳酸菌的菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究還鮮有報(bào)道。本文利用免培PCR-DGGE技術(shù)結(jié)合可培兩種方法對(duì)新疆南疆喀什地區(qū)22個(gè)酸乳樣品中乳酸菌的多樣性進(jìn)行了初步研究，分析其乳酸菌群落結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢(shì)菌，為酸乳制品發(fā)酵劑的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

22份酸乳采集自新疆喀什周邊農(nóng)牧民家庭；革蘭氏陽(yáng)性菌DNA提取試劑盒TIANGEN BIOTECH BEIJING CO.LTD；buffer、dNTP MIX、rTaq、RNA酶、溶菌酶、蛋白酶K均購(gòu)買(mǎi)自寶生物中國(guó)大連有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、Tris-EDTA（TE）、PBS緩沖液、10%SDS、Tris飽和酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，v/v） 均購(gòu)自上海生物工程有限公司。

變性梯度凝膠電泳儀、PCR基因擴(kuò)增儀美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)Syngene；高速冷凍離心機(jī)（12000r/min） 力康有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理及培養(yǎng)基配制22份酸乳樣品采集后保存于滅菌采集管內(nèi)，一式三份（各50mL），冰盒中保存并盡快送回實(shí)驗(yàn)室于4℃保存，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。喀什市采集的樣品標(biāo)記為：KS-4-b、KS-6-B、KS-3-b、ORD、KS-5-b、KS-1-a、KS-a；阿圖什市采集的樣品的樣品標(biāo)記為：ATS-4-c、ATS-3、ATS-1-a、ATS-2-a；塔什庫(kù)爾干縣采集的樣品標(biāo)記為：kb、AH-1-b、T-1-a、W-1-3、C-1-a、TH-1-c、D-1-b、S-1-a、Tz-1-b、Kz-a、sb-1-b。

MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、改良MC培養(yǎng)基配制方法參照相關(guān)資料［9］。

1.2.2乳酸菌的分離鑒定利用生理鹽水將22個(gè)樣品稀釋為10-3、10-4、10-5濃度的菌懸液。取0.1mL菌懸液于加有2%（m/v）碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基、改良MC培養(yǎng)基和M17培養(yǎng)基上涂布均勻，37℃恒溫培養(yǎng)48h。選取細(xì)菌數(shù)量適中的平板，挑取有溶鈣圈的單菌落在MRS培養(yǎng)基上劃線(xiàn)純化。

利用革蘭氏陽(yáng)性菌DNA提取試劑盒。提取乳酸菌基因組。對(duì)基因組進(jìn)行16SrDNA PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為10×PCR buffer 2.5μL，d NTP MIX 2μL，引物27f 1μL，引物1492r 1μL，基因組DNA模板2μL，TaKaRa rTaq酶0.5μL，ddH2O補(bǔ)充至25μL。循環(huán)參數(shù)如下，預(yù)變性5min，94℃變性1min，退火1min，72℃延伸2min，35循環(huán)，72℃末端延伸10min。1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，溴化乙錠染色，于紫外燈下對(duì)條帶進(jìn)行觀察和拍照。PCR成功條帶送于上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3總DNA提取與PCR擴(kuò)增將酸奶用PBS緩沖1∶1（v/v）稀釋?zhuān)?℃ 2000r/min離心5min，收集上清液。上清液于7.5mL無(wú)菌離心管中4℃下6000r/min離心10min，棄去上清液，沉淀在-20℃冰箱中冷凍40min。沉淀溶化后，用2mL PBS緩沖液洗滌2次，4℃6000r/min離心10min棄去上清。沉淀重懸于2mLTE緩沖液，加入溶菌酶（終濃度10mg/mL），37℃水浴lh。加入等體積的CTAB抽提液，65℃處理30min分別加入蛋白酶K（終濃度50mg/mL）和10%SDS溶液（終濃度l%），55℃處理2h。在冰上冷卻后，加入等體積的Tris飽和酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，v/v），12000r/min離心15min。反復(fù)抽提蛋白，上清液轉(zhuǎn)移到另一無(wú)菌離心管中。向上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，-20℃過(guò)夜沉淀DNA，10000r/min離心10min收集DNA沉淀。70%乙醇0.5mL洗滌沉淀2次，待自然晾干后，用50μL TE溶液溶解；最后用終濃度為50mg/mL的RNA酶37℃水浴處理60min，即得基因組DNA粗提取液。所得基因組DNA用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

以總基因組為模板，上游引物為HDA2（5’-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3’）；下游引物為L(zhǎng)ac1GC（5’-CGC CCG GGG CGC CCG GGC CGC GGG GCA CCG GGG CGC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCA GCA GTA GGG AAT CTT CC-3’）。PCR反應(yīng)體系為50μL：3.0μL MgCl2（25mmol），5.0μL 10×buffer（Mg2+free），4.0μL d NTP mix，3.75μL template DNA，0.75μL 10μmol每種引物，0.5μL Taq polymerase（5U/μL），ddH2O補(bǔ)足50μL。

1.2.4DGGE分析DGGE膠的制備：10%聚丙烯酰胺凝膠濃度，變性梯度為30%～55%［10］。在60℃恒溫條件下，75V固定電壓下電泳17h。將DGGE膠放入1× TAE液中（含0.5mg/L EB）在脫色搖床上慢速搖15～20min，回收染色液，將DGGE膠置于適量超純水中，紫外成像系統(tǒng)觀察拍照。

對(duì)PCR-DGGE泳道中的主要亮帶進(jìn)行割膠回收，按1.2.3的方法擴(kuò)增。送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司旗下華大基因測(cè)序。運(yùn)用BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的公開(kāi)序列進(jìn)行比較，確定分離細(xì)菌的種屬。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

采用Quantity one（BIO-RAD）軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的16SrDNA鑒定結(jié)果

對(duì)1.2.2可培實(shí)驗(yàn)中分離得到56株乳酸菌的保守16SrDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，部分?jǐn)U增結(jié)果如圖1。圖1中泳道1～11在1500pb左右的條帶為目的條帶，7、8目的條帶擴(kuò)增失敗，分析可能為模板DNA質(zhì)量太差。對(duì)擴(kuò)增成功的條帶進(jìn)行測(cè)序。

通過(guò)BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的公開(kāi)序列進(jìn)行比對(duì)得到56株菌中德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.）46株，占所篩選菌種數(shù)的82%；發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）2株，占所篩菌種數(shù)的4%；瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）2株，占所篩菌種數(shù)的4%；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus strain）1株，占所篩菌種數(shù)的2%；雞乳桿菌（Lactobacillus gallinarum）2株，占所篩菌種數(shù)的4%；屎腸球菌（Enterococcus faecium）1株，占所篩菌種數(shù)的2%；耐久腸球菌（Enterococcus durans）2株，占所篩菌種數(shù)的4%。

2.2DNA提取與PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別從22個(gè)酸奶樣品中提取總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳成像，部分樣品DNA電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2中目的條帶為15000pb左右，出現(xiàn)少許拖尾現(xiàn)象，但不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1　部分16SrDNA區(qū)域擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　16SrDNA region amplification results

圖2　瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)部分基因組DNA結(jié)果Fig.2　Agarose gel electrophoresis for detection of genomic DNA results

對(duì)22個(gè)酸奶樣品的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得片段大小約為200bp的16SrDNA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，部分樣品16SrDNA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳成像結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3中1～8號(hào)泳道目的條帶清晰，且條帶大小相同。

由圖3看出，1～8號(hào)均有熒光條帶，說(shuō)明PCR成功，滿(mǎn)足后續(xù)DGGE上樣要求。

2.3DGGE電泳圖譜分析

對(duì)樣品總DNA的16SrDNA PCR擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性凝膠梯度電泳，結(jié)果見(jiàn)圖4。

DGGE是一種相對(duì)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)細(xì)菌群落的指紋技術(shù)。根據(jù)DGGE的原理，每一個(gè)條帶大致與群落中的一個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群或操作分類(lèi)單位（operational taxonomic unit，OTU）相對(duì)應(yīng)［11］。

圖3　部分16SrDNA區(qū)域擴(kuò)增結(jié)果Fig.3　16SrDNA region amplification results

圖4　不同酸奶樣品總DNA的16SrDNA PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳圖譜Fig.4　Denaturing gradient gel electrophoresis 16SrDNA PCR products of different yogurt samples of total DNA

如圖4所示，在DGGE電泳圖譜上顯示，每個(gè)樣品經(jīng)過(guò)PCR-DGGE都分離出1～2條明顯的電泳條帶，泳道3、5、6、9、10、14、15、16、18、19、20、21、22中含有2種優(yōu)勢(shì)菌群（a、b），泳道1、4、17菌群?jiǎn)我唬╞），泳道7、8、11、12優(yōu)勢(shì)菌群有兩種（c、d），泳道13優(yōu)勢(shì)菌群為一種（c）。DGGE圖譜上不同條帶代表不同的微生物種類(lèi)，條帶的亮度代表微生物的豐度，條帶越亮則微生物的豐度越高［12］。Quantity one（BIO-RAD）軟件分析結(jié)果顯示，條帶b豐度最高，為44%，為主要優(yōu)勢(shì)菌群。a、c、d為次優(yōu)勢(shì)菌群，所占比列分別為33%、13%、10%。

對(duì)圖4中標(biāo)記的較明顯的條帶進(jìn)行割膠回收、測(cè)序，結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果為：條帶a與德式乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp）相似性為99%，條帶b與瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）相似性為98%，條帶c與德式乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）相似性為98%，條帶d與嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）相似性為98%。

3　結(jié)論

本研究采用可培結(jié)合非可培的PCR-DGGE技術(shù)分析研究了新疆南疆地區(qū)乳酸中乳酸菌的菌落結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢(shì)菌群。傳統(tǒng)可培技術(shù)共分離得到7種乳酸菌，共56株。分別為德氏乳桿菌46株；發(fā)酵乳桿菌2株；瑞士乳桿菌2株；嗜酸乳桿菌1株；雞乳桿菌2株；屎腸球菌1株；耐久腸球菌2株。其中優(yōu)勢(shì)菌為德式乳桿菌。PCRDGGE指紋圖譜中共有4種明亮條帶，通過(guò)測(cè)序比對(duì)得出瑞士乳桿菌為其優(yōu)勢(shì)菌，其他三種德式乳桿菌、德式乳桿菌保加利亞亞種和嗜酸乳桿菌為次優(yōu)勢(shì)菌。結(jié)果顯示采用PCR-DGGE技術(shù)獲得的乳酸菌群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌與采用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)獲得的有一定的差異。

可培技術(shù)和非可培技術(shù)菌顯示德式乳桿菌均為優(yōu)勢(shì)菌群，PCR-DGGE結(jié)果中的其他三種優(yōu)勢(shì)菌群在傳統(tǒng)分離技術(shù)結(jié)果中并未表示出來(lái)。顯示兩種方法存在一定的差異性，可能有以下兩點(diǎn)原因：自然界的微生物可培養(yǎng)的只占小部分，且傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法具有很強(qiáng)的選擇性，不能從根本上反應(yīng)樣本的微生態(tài)系統(tǒng)組成［13-14］。在PCR-DGGE結(jié)果中，只對(duì)大部分樣品中的優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行了分析，但從圖中可以看出，不同的泳道差異較大，推測(cè)這可能與采樣地點(diǎn)和海拔有關(guān)，這有待于后續(xù)研究。

［1］趙蕊，霍貴成.新疆酸奶子中乳酸菌多樣性分析［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43（7）：27-31.

［2］藍(lán)曉雪，胡曉晴，胡敏.新疆乳酸菌的篩選與鑒定［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2012，40（11）：16-20.

［3］董曉婉，李寶坤，李開(kāi)雄.新疆蒙古族傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌多樣性的比較［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（21）：55-60.

［4］夏吉慶，馬添翼，鄭國(guó)香.PCR-DGGE法解析牛糞厭氧發(fā)酵穩(wěn)定期微生物多樣性［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，11（2）：17-22.

［5］Muyzer G.DGGF/TGGE：a method for identifying genes from natural ecosystems［J］.Curr Opin Microbiol，2012，54（2）：317-322.

［6］董曉婉，李寶坤，盧士玲.傳統(tǒng)分離培養(yǎng)結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)分析傳統(tǒng)酸乳制品中的乳酸菌［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（3）：97-101.

［7］曹麗.垃圾和滲濾液中微生物群落分子生態(tài)學(xué)初步研究［D］.武漢：華中科技大學(xué)，2007.

［8］AmannRI，LudwingW，SchleiferKH.Phylogeneticidentification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation［J］.Microbiol Rev，1995，59（1）：143-169.

［9］劉慧.現(xiàn)代食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2006：263-270.

［10］李藝，孟鎮(zhèn)，鐘其頂.用DGGE技術(shù)分析植物乳桿菌對(duì)小鼠腸道菌群失調(diào)的影響［J］.營(yíng)養(yǎng)與保健，2013，34（12）：327-330.

［11］劉煒，馬曉軍，侯書(shū)貴.東天山地區(qū)廟爾溝雪坑中微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境關(guān)系研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2007，47（6）：1019-1026.

［12］Rolleke S，Gurtner C，Drevello U，et al.Analysis of bacterial communities on historical glass by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16SrRNA［J］.Microbiol Methods，1999，36（12）：107-114.

［13］Rossell-Mora R，Amann R.The species concept for prokaryotes［J］.FEMS Microbial REV，2001，25（1）：39-67.

［14］葛錚，趙晗旭，高云航.PCR-DGGE技術(shù)在哺乳動(dòng)物胃腸道微生物多樣性及菌群結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013（12）：985-991.

Preliminary analysis the diversity of lactic acid bacteria in traditional fermented yogurt Kashi，Xinjiang

YUAN Xue-lin，YANG Jie*，HU Min，JIAO Lin
（College of Life Science and Technology of Xinjiang University，Urumqi 830046，China）

In order to analyze the diversity of the 22 traditional fermented yoghurt samples that were collected from Kashi.The technology of PCR-DGGE combining traditional culture isolation methods was used to analyze these 22 samples.The results showed that using traditional methods isolated seven kinds of lactic acid bacteria，which Lactobacillus delbrueckii（L.delbrueckii subsp）was the dominant flora.On the use of PCRDGGE bands were obtained in four and had sequence alignment.The results showed that the highest abundance was Lactobacillus.helveticus，which was the dominant bacteria in yogurt samples，sub-dominant bacteria was Lactobacillus.delbrueckii subsp，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and Lactobacillus acidophilus.Traditional separation technology combined with PCR-DGGE could be more effective and more comprehensive analysis of the microbial diversity of traditional dairy products and the dominant bacteria.

PCR-DGGE；Lactobacillus；dominant bacteria

TS201.4

A

1002-0306（2015）10-0202-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.033

2014－08－26

袁雪林（1989-），女，碩士研究生，研究方向：生化工程。

楊潔（1963-），女，博士研究生，副教授，研究方向：天然化學(xué)產(chǎn)物。