微波協(xié)同纖維素酶提取玉米須綠原酸工藝優(yōu)化

關海寧，喬秀麗，刁小琴，遲彩霞

（1.綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化152061；2.綏化學院食品分析與檢測重點實驗室，黑龍江綏化152061）

微波協(xié)同纖維素酶提取玉米須綠原酸工藝優(yōu)化

關海寧1，2，喬秀麗1，2，刁小琴1，遲彩霞1

（1.綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化152061；2.綏化學院食品分析與檢測重點實驗室，黑龍江綏化152061）

利用響應面法對玉米須綠原酸的微波輔助酶提取工藝進行優(yōu)化。在單因素實驗的基礎上，以微波時間、乙醇濃度、浸提時間為自變量，綠原酸提取量為響應值，研究各自變量交互作用及其對綠原酸提取量的影響。進一步得到微波協(xié)同纖維素酶提取玉米須綠原酸的最佳工藝條件：微波功率240W、微波時間27s、纖維素酶添加量1.4%、乙醇濃度70%、浸提時間1.25h，在此條件下玉米須綠原酸的提取量8.94mg/g。

玉米須，綠原酸，纖維素酶，微波，響應面

玉米須是禾本科作物玉米的花柱和柱頭，是一種傳統(tǒng)的中藥材，可用于治療糖尿病、高血壓、膽結石、腎炎等多種疾病［1］。玉米須中含有多糖、黃酮、生物堿、綠原酸等活性成分具有調(diào)節(jié)免疫，抗癌細胞增殖，抑菌、抗氧化等多種作用［2-5］。我國玉米須資源豐富，但由于缺乏有效的利用，大部分被廢棄。

玉米須綠原酸屬酚類化合物，是一種重要的活性物質(zhì)，具有降血壓、降血脂、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等多種生理功能。傳統(tǒng)提取綠原酸的方法多為有機溶劑浸提，該法提取時間長，提取效果差。微波是近些年廣大科研工作者用于天然植物有效成分提取的一項新技術，它具有高效、安全、節(jié)能、提取率高等特點［6］。纖維素酶能溫和、有效的破壞植物的細胞壁，提高有效成分的溶出率［7］。目前國內(nèi)外尚未見有關微波輔助纖維素酶提取玉米須綠原酸的研究報道。本文通過響應面分析法優(yōu)化微波協(xié)同纖維素酶提取玉米須綠原酸的工藝，以期為玉米須的合理利用和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

成熟玉米須綏化市農(nóng)田采集，自然晾干，粉碎，過80目篩；綠原酸標準品北京中科三捷生物有限公司；纖維素酶（10U/mg） 黑龍江肇東日成酶制劑有限公司；其他試劑均為分析純。

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；美的家用微波爐佛山順德美的微波電器制造有限公司；RE-52A型旋轉蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1纖維素酶-微波提取工藝取3.00g玉米須粉于錐形瓶中，加入6mL蒸餾水攪拌均勻，于指定微波功率條件下微波相應時間后，取出晾涼后加入一定量的纖維素酶，并加入無水乙醇和蒸餾水使浸提溶液為一定體積分數(shù)的乙醇溶液且料液比1∶20（g/mL），再在50℃的水浴中浸提一定時間后，沸水浴滅酶5min，過濾除渣，所得濾液減壓濃縮，再用60%的乙醇定容至25mL容量瓶，所得樣待檢測［8-9］。

1.2.2綠原酸提取量的計算最大吸收波長的確定：用60%的乙醇溶液溶解綠原酸標準品，得到綠原酸標準液（43mg/L），取適量綠原酸標準液于200～450nm波長范圍內(nèi)進行掃描，在波長327nm處有最大吸收峰，故最大吸收波長選擇327nm。以下實驗以327nm作為測定吸光度的波長。

標準曲線的制作：精密吸取以上綠原酸標準液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，分別置于10mL容量瓶中，加60%乙醇溶液定容，搖勻。用分光光度法在327nm波長條件下測定吸光值，以綠原酸標準樣品質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得標準回歸方程Y=0.0556X-0.0134，相關系數(shù)R2=0.9996。結果表明綠原酸濃度在5～25mg/L的范圍內(nèi)呈良好的線性相關性。

綠原酸含量的測定：取不同提取方法所得樣品液0.2mL，于10mL刻度試管中，定容至4mL，按標準曲線制作的步驟進行，于波長327nm處比色測定其吸光值，以60%乙醇溶液為空白參比，然后根據(jù)線性回歸方程計算出每毫升提取液中的綠原酸含量，再根據(jù)下式計算總綠原酸提取量。

式中：C—依據(jù)標準曲線計算出測定樣液的質(zhì)量濃度（mg/L）；V2—測定吸光度時樣液的定容體積（mL）；V1—提取液總體積（mL）；V0—測定吸光度移取樣液的體積（mL）；W—樣品重量（g）。

1.2.3單因素實驗

1.2.3.1微波作用功率對綠原酸提取量的影響微波時間30s，纖維素酶添加量1.0%，浸提劑乙醇濃度60%，料液比1∶20（g/mL），浸提溫度50℃，浸提時間1.0h，考察微波作用功率（0、80、240、400、640、800W）對綠原酸提取量的影響。

1.2.3.2微波時間對綠原酸提取量的影響微波功率240W，纖維素酶添加量1.0%，浸提劑乙醇濃度60%，料液比1∶20（g/mL），浸提溫度50℃，浸提時間1.0h，考察微波時間（0、20、40、60、80、100s）對綠原酸提取量的影響。

1.2.3.3纖維素酶添加量對綠原酸提取量的影響微波功率240W，微波時間20s，浸提劑乙醇濃度60%，料液比1∶20（g/mL），浸提溫度50℃，浸提時間1.0h，考察纖維素酶添加量（0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%）對綠原酸提取量的影響。

1.2.3.4浸提劑乙醇濃度對綠原酸提取量的影響微波功率240W，微波時間20s，纖維素酶添加量1.4%，料液比1∶20（g/mL），浸提溫度50℃，浸提時間1.0h，考察浸提劑乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）對綠原酸提取量的影響。

1.2.3.5浸提時間對綠原酸提取量的影響微波功率240W，微波時間20s，纖維素酶添加量1.4%，浸提劑乙醇濃度60%，料液比1∶20（g/mL），浸提溫度50℃，考察浸提時間（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h）對綠原酸提取量的影響。

1.2.4響應面實驗設計在單因素實驗的基礎上，選取較佳的微波功率和纖維素酶添加量，以綠原酸提取量為評價指標，浸提時間、微波時間、乙醇濃度3個因素進行Box-Behnken中心組合設計實驗［10］，確定最佳提取工藝條件，因素水平編碼見表1。

表1　響應面實驗因素和水平編碼值Table 1　Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in response surface analysis

1.2.5數(shù)據(jù)處理每個實驗重復3次，結果表示為x± s。采用statistix 8.0（Analystical Software Inc.，USA）的Linear Models程序進行，用Tukey HSD程序對差異顯著性（p＜0.05）或差異極顯著性（p＜0.01）進行分析，采用Sigmaplot 11.0軟件作圖。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1微波作用功率對綠原酸提取量的影響不同的微波作用功率對綠原酸提取量的影響結果見圖1。

圖1　微波功率對綠原酸提取量的影響Fig.1　Effect of microwave power on extraction rate of chlorogenic acid

圖1看出，隨著微波功率的提高，綠原酸提取量增加，這是因為逐漸增加的熱量使細胞內(nèi)水分汽化而實現(xiàn)微波破壁的能力逐漸加強，有效物質(zhì)更易溶出。微波功率為240W時提取量顯著提高（p＜0.05）。當微波功率繼續(xù)提高時，由于較大的微波功率會使樣品溫度瞬間升高，使綠原酸變性造成其損失，故微波功率為240W為宜。

2.1.2微波時間對綠原酸提取量的影響不同的微波時間對綠原酸提取量的影響結果見圖2。

圖2　微波時間對綠原酸提取量的影響Fig.2　Effect of microwave time on extraction rate of chlorogenic acid

由圖2看出，隨著微波時間的延長，綠原酸提取量逐漸增加，20s時達到最大（p＜0.05），再隨著微波時間的延長，提取量反而下降，這可能是由于微波時間過短，破壁不完全，而長時間的微波輻射會導致樣品溫度升高，使綠原酸變性，故微波時間選擇20s為宜。

2.1.3纖維素酶添加量對綠原酸提取量的影響不同纖維素酶添加量對綠原酸提取量的影響結果見圖3。

圖3　纖維素酶添加量對綠原酸提取量的影響Fig.3　Effect of cellulase addition amount on extraction rate of chlorogenic acid

由圖3看出，纖維素酶添加量在0.8%～1.4%的范圍內(nèi)，隨著纖維素酶添加量的增加，綠原酸提取量顯著增加（p＜0.05），這是因為纖維素酶能有效分解細胞壁中的纖維素，使有效物質(zhì)更好的溶出。當添加量為1.4%以后，隨著加酶量的增加，綠原酸提取量增加并不顯著（p＞0.05），這可能是由于繼續(xù)添加的酶已經(jīng)沒有足夠的底物與之反應，因此綠原酸提取量變化不明顯。故為了節(jié)省酶的用量，纖維素酶的添加量為選擇1.4%為宜。

2.1.4浸提劑乙醇濃度對綠原酸提取量的影響不同的浸提劑乙醇濃度對綠原酸提取量的影響結果見圖4。

由圖4看出，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸提取量顯著增加（p＜0.05），當乙醇濃度為60%時，提取量達到最大。隨后隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加，提取量反而顯著（p＜0.05）下降，這可能是由于高濃度的乙醇一方面更易于揮發(fā)，使的乙醇濃度依然會降低；另一方面可能會溶出一些雜質(zhì)，導致綠原酸的提取量下降，故乙醇濃度選擇60%為宜。

2.1.5浸提時間對綠原酸提取量的影響不同的浸提時間對綠原酸提取量的影響結果見圖5。

圖4　乙醇濃度對綠原酸提取量的影響Fig.4　Effect of ethanol concentration on extraction rate of chlorogenic acid

圖5　浸提時間對綠原酸提取量的影響Fig.5　Effect of extraction time on extraction rate of chlorogenic acid

由圖5看出，隨著浸提時間的延長，玉米須綠原酸提取量顯著增加（p＜0.05）；當浸提時間大于1.5h后，隨著浸提時間的延長，綠原酸提取量趨于平緩，差異不顯著（p＞0.05）。這可能是由于當時間為1.5h時，綠原酸已基本浸出，從節(jié)約能源角度考慮，浸提時間選擇1.5h為宜。

2.2響應面優(yōu)化實驗

2.2.1實驗結果及方差分析在單因素實驗的基礎上，對浸提時間、微波時間、乙醇濃度進行三因素三水平響應面實驗設計，結果見表2。

將表2所得數(shù)據(jù)采用Design Expert軟件進行回歸分析，三個因素經(jīng)擬合得到以綠原酸提取量（Y）為目標函數(shù)的二次回歸方程：

Y=－19.74542+13.93000X1+0.47808X2+0.34875X3－0.097500X1X2－0.094500X1X3+0.000925X2X3－1.87833X12－0.00779583X22－0.00154583X32。

回歸模型的方差結果（表3）表明，浸提時間、微波時間、乙醇濃度對綠原酸提取量的影響極顯著（p＜0.01），且大小順序為微波時間（X2）、乙醇濃度（X3）、浸提時間（X1）。回歸模型p=0.0007＜0.01達到極顯著水平，說明該方程能夠準確反映綠原酸提取量與各因素之間的關系。失擬項p=0.1249＞0.05，不顯著，說明方程對實驗擬合良好，實驗誤差小。相關系數(shù)R2= 0.9827，表明有98.27%的數(shù)據(jù)可以用此回歸模型來解釋。

2.2.2雙因素交互分析由方差分析（表3）看出，本實驗所建立的數(shù)據(jù)模型中X1X2（浸提時間與微波時間）、X1X3（浸提時間與乙醇濃度）的交互作用均達到極顯著水平（p＜0.01），即它們的交互作用對玉米須綠原酸提取量有極顯著影響，其交互作用響應面圖如圖6所示。

表2　Box-Behnken實驗設計及結果Table 2　Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析Table 3　Results of variance analysis using the regression model

圖6　各因素交互作用對綠原酸提取量的影響Fig.6 Response surface for the effects of extraction time，microwave time，ethanol concentration on extraction rate of chlorogenic acid

由圖6看出，微波時間相對于乙醇濃度、浸提時間的曲線較陡，等高線沿著微波時間軸變化相對密集，說明微波時間的影響較顯著。微波時間固定時，乙醇濃度的曲線比浸提時間的陡峭，且等高線隨著乙醇濃度值變化相對密集，說明乙醇濃度的影響比浸提時間的影響大，這與回歸模型的方差分析結果一致。

2.2.3最佳提取工藝條件的確定通過軟件分析，得出最優(yōu)的提取工藝條件為浸提時間1.25h，微波時間27.03s，乙醇濃度70%，此時玉米須綠原酸提取量達到最大值8.98409mg/g。為檢驗結果的可靠性，考慮到實驗操作的可行性，采用浸提時間1.25h，微波時間27s，乙醇濃度70%，在此條件下進行實驗，得到玉米須綠原酸的實際提取量為8.94mg/g，與理論預測的誤差為0.4%，說明響應面優(yōu)化得到的提取工藝條件準確可靠，具有可行性。

3　結論

利用微波協(xié)同酶法提取玉米須中的綠原酸，具有提取條件溫和，提取效率高，省時、節(jié)能等優(yōu)點。在單因素實驗的基礎上，采用響應面法對微波-纖維素酶輔助提取玉米須綠原酸的工藝條件進行了優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)浸提溫度、微波時間、乙醇濃度對綠原酸提取量影響均極顯著（p＜0.01）；在因素交互作用中，只有微波時間與乙醇濃度的交互作用不顯著。纖維素酶協(xié)同微波提取的最優(yōu)工藝條件為微波功率240W、微波時間27s、纖維素酶添加量1.4%、浸提時間為1.25h、乙醇濃度70%，在此條件下玉米須綠原酸提取量為8.94mg/g。

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Optimization of microwave-assisted cellulase pretreatment extraction for chlorogenic acid from corn silk

GUAN Hai-ning1，2，QIAO Xiu-li1，2，DIAO Xiao-qin1，CHI Cai-xia1
（1.College of Food and Pharmaceutical Engineering，Suihua College，Suihua 152061，China；2.Key Laboratory of Food Analysis and Detection，Suihua College，Suihua 152061，China）

The optimum conditions for the extraction of chlorogenic acid from corn silk were determined using response surface methodology.On the basis of single-factor experiments，selecting microwave time，ethanol concentration and extraction time as independent variables，response surface methodology was applied to investigate the effect of three variables on extraction rate of chlorogenic acid.The optimal extraction conditions were obtained as follows:microwave power 240W，microwave time 27s，cellulase addition amount 1.4%，ethanol concentration 70%，and extraction time 1.25h.Under these conditions，the extraction rate of chlorogenic acid was up to 8.94mg/g.

corn silk；chlorogenic acid；cellulase；microwave；response surface methodology

TS210.1

A

1002-0306（2015）10-0198-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.032

2014－07－21

關海寧（1980-），男，碩士研究生，副教授，主要從事食品營養(yǎng)與分析檢測及副產(chǎn)物綜合利用方面的研究。

綏化學院2014年科學技術研究資助項目［K1401011］。