中心組合設計優化大曲中地衣芽孢桿菌發酵產香條件

明紅梅，郭　志，周　健，陳蒙恩，許德富，姚　霞

（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000）

中心組合設計優化大曲中地衣芽孢桿菌發酵產香條件

明紅梅1，郭志1，周健1，陳蒙恩1，許德富2，姚霞1

（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000）

采用中心組合法對大曲中地衣芽孢桿菌X19發酵產香條件進行優化。在前期單因素的基礎上，選取發酵后樣品中苯乙醇、愈創木酚、2，3，5-三甲基吡嗪三種重要大曲香味物質的色譜峰面積為響應值，原料水分含量、裝料量、發酵溫度為自變量，利用Box-Behnken中心組合法對發酵產香條件進行優化。結果表明：在發酵溫度為36℃、水分為47%、裝料量為140g/250mL的最優條件下發酵9d，苯乙醇、愈創木酚、2，3，5-三甲基吡嗪三種大曲香味物質的色譜峰面積的平均值為5.72×108，接近于模型預測值5.60×108，此時發酵產物中三種香味物質的總含量為14.36mg/100g，與優質濃香型大曲相比，三種香味物質總量增長了約9倍，其中，愈創木酚增長了約11倍，2，3，5-三甲基吡嗪增長了約27倍，表明通過中心組合法優化的回歸方程具有一定的可行性。

響應面優化，地衣芽孢桿菌，濃香型大曲，香味物質

大曲富含眾多香味成分，這些香味成分是白酒香味成分及其前體物質的來源之一。因此，大曲被認為是一種生香劑，其質量直接影響到大曲酒的品質和風味特征。大曲中的香味成分主要是由制曲過程中各種微生物利用原料中的淀粉、蛋白質等營養物質繁殖代謝，分泌各種酶類，在酶和溫度的作用下，經過一系列復雜的化學和生物化學反應產生［1］。這些香味成分的形成，受到微生物區系、環境條件及工藝等因素的影響。

固態法白酒的香味成分主要由釀造過程中微生物的發酵作用產生。而液態法白酒和固液法白酒中則允許添加適量食用香料［2-3］。隨著人們生活水平的提高和健康意識的增強，越來越重視食品的安全性，對化學合成香料在白酒中的使用一直存有爭議。因此，采用微生物發酵的方式來強化香味物質的生成和積累，進一步提高大曲質量，改善白酒風味，成為當前研究的熱點［4］。

響應面法是通過回歸方程分析來尋求最優條件參數的一種實驗設計方法，該法在減少實驗次數的同時可以考慮因素間的交互作用，因此被廣泛應用于生物、食品等領域［5-6］。本研究以傳統濃香型大曲中分離篩選的一株產香地衣芽孢桿菌為研究對象，在單因素實驗的基礎上，利用Box-Behnken實驗設計方法及響應面分析法，對其發酵產香（2，3，5-三甲基吡嗪、愈創木酚、苯乙醇）條件進行優化［7］，以期為固體香曲的開發及應用提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種地衣芽孢桿菌X19，從瀘州老窖制曲生態園的傳統濃香型大曲中篩選獲得；菌種活化培養基蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，瓊脂14g，蒸餾水1000mL，pH7.2，121℃下滅菌20min；細菌種子培養基蛋白胨10g，氯化鈉2.5g，葡萄糖5g，蒸餾水500mL，pH7.4～7.6，分裝于試管中，121℃滅菌20min；小麥固體培養基將適度粉碎后的小麥稱取適量分裝于250mL三角瓶中，121℃滅菌20min。

SW-CJ-1F型超凈工作臺蘇州蘇潔凈化設備有限公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭美國Supelco公司；SKY-2102C型搖床上海蘇坤實業有限公司；手動SPME進樣器、15mL帶硅橡膠墊的樣品瓶美國Supelco公司；Agilent 6890N-5975B氣相色譜-質譜聯用儀美國安捷倫公司；GZ-250-M恒溫培養箱韶關市廣智科技設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1產香實驗菌株X19經活化后接入種子培養基，在37℃下培養18h后調節種子液濃度至108個/mL。以10%接種量接種于小麥固體培養基進行發酵。發酵9d后對發酵產物進行聞香評定、揮發性成分定性分析和半定量分析。

1.2.2聞香評定由10名經過聞香訓練的人員組成評定小組，對各實驗組發酵后的樣品進行外觀、氣味評定。

1.2.3揮發性物質檢測［8］萃取條件將樣品研磨后精確稱取4.0g，于15mL進樣瓶中60℃水浴平衡15min，經頂空吸附30min、230℃氣質聯用儀解析3min后進行鑒定。氣相色譜條件：毛細管色譜柱為DB-WAX，規格為60m×250μm，0.25μm；手動進樣，進樣口溫度250℃；程序升溫：初始40℃穩定1min后，以3℃/min的速率升至180℃，再以2.5℃/min升至230℃，穩定10min；汽化室溫度250℃；載氣He，流速1mL/min。質譜條件：EI電離源，掃描范圍20～500u，電子能量70eV，離子源溫度250℃，接口溫度230℃。采用氣相色譜-質譜聯用儀檢測樣品的揮發性物質得到質譜圖。

1.2.4定性與半定量分析定性分析：將檢出的揮發性物質的質譜圖與標準譜庫（NIST）進行比對，匹配度＞800的結果予以公布。半定量分析：以正丁醇為內標，將樣品揮發性物質的濃度與正丁醇質量濃度作比進行計算，公式如下。

式中，C為樣品中揮發性物質的濃度（mg/100g樣品）；Cis為內標物終濃度（mg/100g樣品）；Ac為揮發性物質的峰面積；Ais為內標物的峰面積。

1.2.5單因素實驗通過控制變量法，分別研究溫度為21、29、37、45、53℃時（固定裝料量為100g/250mL，水分含量為36%）、裝料量為80、100、120、140、160g/ 250mL時（固定水分含量為36%，發酵溫度為37℃）及初始水分含量為26%、36%、46%、56%、66%時（固定發酵溫度為37℃，裝料量為140g/250mL）對菌株X19發酵結果的影響，并對最佳發酵參數進行選取。

1.2.6響應面優化在單因素實驗時，采用單一變量法，依次改變發酵溫度、裝料量和原料水分含量，以三種大曲重要香味物質（苯乙醇、愈創木酚、2，3，5-三甲基吡嗪）的色譜峰面積為評價指標進行優化設計并確定最佳優化參數，進行17組5個中心點的Box-Behnken響應面分析［9-11］，所有實驗除非特殊說明均設3個重復，其各因素水平及編碼見表1。

表1　Box-Behnken實驗因素及水平Table 1　Factors and levels in the Box-Behnken experimental design

1.3數據處理

響應面實驗結果處理運用Design-Expert 8.0.5軟件分析；差異間的顯著性檢驗采用SPSS 19.0軟件分析。

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果與分析

2.1.1溫度對菌株X19發酵產香的影響通過設置不同的變溫梯度，研究其對菌株X19發酵產香的影響，結果見圖1。從圖1可知，苯乙醇在37℃下發酵其含量最高，這與苯乙醇可由苯丙氨酸轉化而來，其含量與蛋白酶活性及底物中苯丙氨酸含量有關；經分析檢測可知，37℃時蛋白酶活性最高，可達77.10U，有利于苯乙醇的積累。愈創木酚的含量在各溫度條件下變化差異不大，這可能是由于愈創木酚的生成受溫度影響不明顯。2，3，5-三甲基吡嗪的生成量隨溫度上升呈現先增加后下降趨勢，且在37℃時其生成量最大。這可能是由于2，3，5-三甲基吡嗪的生成與原料中的氨基酸的含量及糖含量有關，在該溫度下，菌體生長旺盛，活菌數、酶活均較高，發酵基質中氨基酸等氨基化合物、還原糖等羰基化合物含量較高，促進了2，3，5-三甲基吡嗪的生成；溫度過高和過低時菌株X19的生長均受到抑制，酶活降低，致使2，3，5-三甲基吡嗪的生成量降低。綜合考慮重要香味成分的生成量，選取29、37、45℃作菌株X19發酵產香的響應面分析以確定最佳發酵溫度。

圖1　溫度對重要香味物質的影響Fig.1　Influence of temperature on the important aroma components content

2.1.2裝料量對菌株X19發酵產香的影響通過設置不同的裝料梯度，研究其對菌株X19發酵產香的影響，結果見圖2。從圖2可知，三種重要香味成分的色譜峰面積在裝料量為140g/250mL時最大。在不同裝料量條件下發酵后苯乙醇與愈創木酚含量的變化均不明顯，這可能是由于菌株X19生成苯乙醇和愈創木酚受裝料量的影響較小。2，3，5-三甲基吡嗪的生成量隨著裝料量的增加呈現先上升后下降趨勢，這可能是由于X19為兼性厭氧菌，隨著基質溶氧量的降低，其在微氧環境下菌體數、蛋白酶活較高，有利于2，3，5-三甲基吡嗪的合成，當基質中溶氧量過低時，菌株X19的增殖速度受到限制，致使其產量降低。綜合考慮重要香味成分的生成量，選取裝料量120、140、160g/250mL作菌株X19發酵產香的響應面分析以確定最佳裝料量。

圖2　裝料量對重要香味物質的影響Fig.2　Influence of loading weight on the important aroma components content

2.1.3水分含量對菌株X19發酵產香的影響通過設置不同的初始水分含量，研究其對菌株X19發酵產香的影響，結果見圖3。從圖3可知，苯乙醇的含量隨著水分含量的增大呈現一個先增加后平穩的趨勢，但其色譜峰面積差異不大。愈創木酚的生成量隨水分含量的增高變化幅度不明顯。2，3，5-三甲基吡嗪的生成量隨含水量的增加而呈現先增加后下降趨勢，這可能是因為含水量增加，蛋白酶活性增強，氨基酸生成量較高，有利于該物質的積累；當水分過高時可能導致基質多孔性及溶氧量降低，不利于菌體生長繁殖，從而影響2，3，5-三甲基吡嗪的生成。圖3結果顯示，總色譜峰面積及2，3，5-三甲基吡嗪的生成量均在水分含量為46%時出現最大值，因此選取水分含量36%、46%、56%作菌株X19發酵產香的響應面分析以確定最佳水分含量。

圖3　水分含量對重要香味物質的影響Fig.3　Influence of moisture content on the important aroma components content

2.2響應面優化發酵產香條件

2.2.1響應面實驗設計及結果對菌株X19發酵產香條件進行響應面分析，具體實驗設計及結果見表2。運用Design-Expert 8.0.5軟件進行二次回歸擬合后，得到以下回歸方程：

Y=5.575×108－2.512×107A+1.924×107B+1.499× 106C－1.358×108AB+2.042×107AC－3.921×107BC－1.512×108A2－1.797×108B2－1.407×108C2

表2　Box-Behnken實驗設計及結果Table 2　The experimental design and results for response surface analysis

回歸模型方差分析見表3。由表3可知，Pr值小于0.01，F值為13.970，說明本模型為極顯著。由方差分析可知，模型失擬項（lack of fit）中Pr＞0.05，說明該模型選擇比較合理。A、B、AB、A2、B2、C2的Pr值小于0.05，表明這些因素對模型影響顯著，該方程對實驗擬合情況較好。模型系數R2為98.21%，表明該模型與實際情況擬合良好，可以用于菌株X19最佳發酵產香條件的分析和預測。

表3　Box-Behnken Design回歸模型方差分析Table 3　Regression model analysis of variance of the Box-Behnken Design

2.2.2各因素之間的交互作用利用響應面回歸分析、回歸方程和Design-Expert 8.0.5軟件繪制三維響應曲面圖，探究兩兩因素間交互作用對菌株X19發酵產香的影響，結果見圖4～圖6。由圖4～圖6中的響應曲面可以看出，溫度和初始水分含量對菌株X19發酵產香的影響非常顯著，而裝料量對菌株X19發酵產香的影響不是很大，溫度和初始水分含量過高或過低都會使菌株X19發酵產香的含量降低。當各因素大小從四周逐漸趨向中心點時，曲面圖呈凸起趨勢，說明相關因素交互作用越強，即菌株X19發酵產香能力趨向最大化，說明存在最大響應值［12］。運用Design-Expert 8.0.5軟件對結果進行分析，當預測的響應值最大時，三個因素的最佳值：溫度為35.950℃，水分為47.040%，裝料量為139.620g/250mL，預測三種重要大曲香味成分的色譜峰峰面積為5.602×108。考慮到實際情況，采用溫度為36℃，水分為47%，裝料量為140g/250mL進行驗證實驗，重復3次，結果顯示，發酵產物中三種重要大曲香味物質色譜峰面積的平均值為5.722×108，與預測值5.602×108相接近，證明擬合模型能較好的找出菌株X19的最佳發酵產香條件。

圖4　溫度和水分含量對總香味物質含量影響的曲面圖Fig.4　Response surface of temperature and moisture content on tatal aroma components content

圖5　溫度和裝料量對總香味物質含量影響的曲面圖Fig.5　Response surface of temperature and loading weight on tatal aroma components content

圖6　水分和裝料量對總香味物質含量影響的曲面圖Fig.6　Response surface of moisture content and loading weight on tatal aroma components content

表4　香味成分定量分析結果（mg/100g）Table 4　The quantitative analysis content of flavor component in different sample（mg/100g）

2.3定量分析結果

以正丁醇為內標物，對菌株X19在最優條件下的發酵產物、優質濃香型大曲、小麥原料中的苯乙醇、愈創木酚、2，3，5-三甲基吡嗪含量進行定量分析，結果見表4及圖7～圖9。由表4及圖7～圖9色譜峰可知，細菌X19發酵產物中，苯乙醇、愈創木酚、2，3，5-三甲基吡嗪含量相較于小麥原料均有顯著（p＜0.05）的提高，愈創木酚、2，3，5-三甲基吡嗪含量相較于優質濃香型大曲也有顯著（p＜0.05）提高，三種大曲香味成分的總含量增長了8.789倍，其中，愈創木酚的含量增長了11.25倍，2，3，5-三甲基吡嗪含量增長了26.99倍。

圖7　小麥原料中揮發性物質GC-MS總離子流色譜圖Fig.7　The GC-MS total ion current chromatogram of wheat feedstock

圖8　優質濃香型大曲中揮發性物質GC-MS總離子流色譜圖Fig.8　The GC-MS total ion current chromatogram of quality Luzhou Daqu

圖9　X19發酵產物中揮發性物質GC-MS總離子流色譜圖Fig.9　The GC-MS total ion current chromatogram of volatile substance fermentated by X19

3　結論

采用響應面法對傳統濃香型大曲中分離篩選的地衣芽孢桿菌X19的產香條件進行優化，取得了明顯效果：細菌X19在溫度為36℃，水分為47%，裝料量為140g/250mL的最優條件下進行固體小麥產香實驗，發酵9d后苯乙醇、愈創木酚、2，3，5-三甲基吡嗪三種大曲香味成分色譜峰面積的平均值為5.722× 108，與預測值較為接近。發酵產物中苯乙醇含量為0.452mg/100g樣品，愈創木酚含量為1.710mg/100g樣品，2，3，5-三甲基吡嗪含量為12.200mg/100g樣品。相較于優質濃香型大曲中三種香味物質的總含量增長了約9倍。通過微生物發酵獲得大曲中重要香味成分的方式可用于后期制備香曲，并直接應用于白酒釀造或利用現代分離技術對香味成分進行提取和應用，從而改善白酒風味，提升大曲酒的品質，摒除了化學合成香料在白酒生產中使用的不安全隱患，具有很好的開發前景。后續還需進一步對地衣芽孢桿菌X19進行放大實驗研究，為固體香曲制備及工業應用提供參考。

［1］沈才洪，應鴻，許德富，等.大曲質量標準的研究（第三報）：大曲生香力的特征指標探討［J］.釀酒科技，2005（8）：20-22.

［2］余乾偉.酒類添加劑的正確選擇及開發應用［J］.釀酒科技，2009（7）：68-72.

［3］GB 2760-2011，食品添加劑使用標準［S］.

［4］趙爽，楊春霞，竇屾，等.白酒生產中釀酒微生物研究進展［J］.中國釀造，2012，31（4）：5-10.

［5］代志凱，張翠，阮征.實驗設計和優化及其在發酵培養基優化中的應用［J］.微生物學通報，2010，37（6）：894-903.

［6］陳湘寧，李宇華，丁軻，等.響應面法優化超聲波輔助提取柿子多糖的工藝研究［J］.中國食品學報，2012，12（7）：105-111.

［7］周健，郭志，明紅梅，等.優質中高溫濃香型大曲主要香味成分的初步研究［J］.釀酒科技，2013（4）：11-14.

［8］ZHANG Rong，WU Qun，XU Yan.Aroma characteristics of Moutaiflavorliquor produced with Bacillus licheniformis by solid state fermentation［J］.Litters in Applied Microbiology，2013，57（1）：11-18.

［9］Sahin Selin，Samli Ruya.Optimization of olive leaf extract obtained by ultrasound-assisted extraction with response surface methodology［J］.Ultrasonice Sonochemistry，2013，20（1）：595-602.

［10］安俊瑩，劉穎，朱雯娟，等.響應面法優化Bacillus amyloliquefaciens ZJHD-06產類細菌素發酵培養基［J］.食品工業科技，2014，35（1）：191-195.

［11］Fan J P，Cao J，Zhang XH，et al.Optimization of ionic liquid based ultrasonic assisted extraction of puerarin from Radix Puerariae Lobatae by response surface methodology［J］.Food Chemistry，2012，135（4）：2299-2306.

［12］李市場，張鵬鵬，楊娜，等.黏紅酵母產油脂培養基的響應面優化［J］.中國糧油學報，2013，28（2）：63-68.

Optimization of flavor components fermentation conditions of Bacillus licheniformis from daqu by central composite design

MING Hong-mei1，GUO Zhi1，ZHOU Jian1，CHEN Meng-en1，XU De-fu2，YAO Xia1
（1.College of Bioengineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，China；2.Luzhou Laojiao Co.，Ltd.，Luzhou 646000，China）

Central composite design methodology was applied to optimize the fermentation conditions of Bacillus licheniformis from Daqu.On the basis of single factor test，the optimization about dependent variables（phenethyl alcohol，guaiacol and three main flavoring substances chromatographic peak area）and independent variables（fermentation temperature，loading weight and moisture content）was carried out by using central composite design.The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows:fermentation temperature 36℃，47%moisture，loading weight of 140g/250mL.Fermentation 9 days under this conditions，the average peak area of three main flavoring substances for 5.72×108，which were well matched with the predictive value 5.60×108，the total content of the fermentation product of three flavoring substances as 14.36mg/100g，compared with the high-quality Luzhou Daqu，three total flavoring substances increased by about 9 times，which guaiacol increased by about 11 times，2，3，5-trimethyl-pyrazine increased about 27 times.Optimized by central composite design had good reliability.

response surface methodology；Bacillus licheniformis；Luzhou flavor Daqu；flavor components

TS261.4

A

1002-0306（2015）10-0182-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.029

2014－08－26

明紅梅（1971-），女，碩士，副教授，主要從事釀酒生物技術及應用方面的研究。

釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室項目（NJ2011-13）；瀘州老窖科研獎學金項目（13ljzk04）；自貢市重點科技計劃項目（2013X04）；四川省高等教育質量工程項目（2011-659）。