基于代謝工程策略合成L-蘋果酸研究進展

周　麗，崔文璟，劉中美，周哲敏

（江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

基于代謝工程策略合成L-蘋果酸研究進展

周麗，崔文璟，劉中美，周哲敏*

（江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

L-蘋果酸在食品、醫藥、化工等領域被廣泛應用。工業上以石油基原料為底物，通過化學法或酶法合成L-蘋果酸。隨著石油資源的日漸短缺，利用可再生資源以生物法合成L-蘋果酸受到人們的重視。近年來應用代謝工程策略改造大腸桿菌、酵母菌等菌株，進行L-蘋果酸的合成，具有一定應用前景。同時，應用合成代謝工程在體外構建代謝途徑進行L-蘋果酸合成，具有較高的理論價值。本文首先總結了L-蘋果酸合成的代謝途徑；其次對L-蘋果酸合成的代謝工程策略進行了綜述，包括強化L-蘋果酸合成代謝途徑、刪除副產物合成途徑、促進還原力再生，以期較為系統地闡述L-蘋果酸代謝機制的研究現狀；最后對L-蘋果酸代謝工程的研究方向進行了展望。

L-蘋果酸，代謝工程，微生物發酵，還原力再生

L-蘋果酸是一種重要的四碳平臺化合物，已被美國能源部列為基礎化合物之一。其應用領域涉及食品、醫藥、化工等行業［1-2］。在食品領域，L-蘋果酸已成為繼檸檬酸、乳酸之后，用量排第三位的食品酸味劑，同時L-蘋果酸還可用于食品保鮮和除臭［3］。在醫藥行業中，L-蘋果酸直接參與人體新陳代謝，具有抗疲勞、保護肝、腎、心臟的作用以及降低抗癌藥物的毒副作用等［3-4］。在化工領域，L-蘋果酸被用于日用化妝品的生產［3］，金屬的清洗和修整，織物整理，化學鍍層等［5］。此外，L-蘋果酸也可用于生產聚酯樹脂和醇酸樹脂等特殊的可降解塑料［6］，這將極大促進其需求量。

化學合成法將馬來酸或富馬酸水合，可合成消旋型DL-蘋果酸［7］，而一些國家規定飲料和藥品中不能使用DL-蘋果酸，必須使用L-蘋果酸，限制了消旋型蘋果酸的應用范圍。利用含有富馬酸酶的固定化細胞或者固定化富馬酸酶，可合成光學純度的L-蘋果酸［1，7-8］，然而其底物富馬酸來源于馬來酸，是石油基化學品［9］。隨著石油資源的日漸枯竭，利用可再生資源，通過微生物發酵法合成L-蘋果酸受到人們的關注［5］。

傳統發酵利用黃曲霉菌株發酵合成L-蘋果酸［10］。然而，該菌株發酵周期長，產生黃曲霉毒素，并產生高濃度雜酸導致產品分離純化困難，限制了其工業應用［10-11］。而L-蘋果酸作為TCA循環的中間代謝產物，在其他微生物中很少積累。因此，對多條代謝途徑進行改造以致L-蘋果酸代謝溢出是利用安全菌株進行L-蘋果酸發酵合成的必然選擇。代謝工程是利用重組DNA技術，有目的地操縱細胞的酶、轉運和調控功能，從而改善細胞的活性［12-13］，從上世紀90年代初期發展至今，涌現出了大量新的理論和技術，對微生物發酵工業的發展起到了極大的推動作用［14］。近年來應用代謝工程策略，對大腸桿菌［15-18］、酵母菌［19-20］以及枯草芽孢桿菌［21］等微生物代謝途徑進行改造，高水平合成L-蘋果酸也成為研究熱點。同時，應用合成代謝工程在體外構建代謝途徑進行L-蘋果酸合成，具有一定的理論價值。本文對代謝工程方式進行L-蘋果酸合成的相關研究進行綜述（表1），以期較為系統地闡述L-蘋果酸代謝機制的研究現狀。

1　L-蘋果酸合成代謝途徑

微生物可利用葡萄糖底物，經糖酵解途徑和三羧酸循環（TCA）合成L-蘋果酸（圖1）。這一過程中，L-蘋果酸積累的方式可總結為五種［20］（圖2）：（A）丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸羧化為草酰乙酸（OAA），草酰乙酸再經蘋果酸脫氫酶（MDH，EC 1.1.1.37，可逆催化草酰乙酸和蘋果酸之間的氧化還原反應）還原為L-蘋果酸，葡萄糖經這一途徑每合成1分子L-蘋果酸需固定1分子CO2，其最大理論得率為2mol蘋果酸/mol葡萄糖；（B）第二種是由草酰乙酸和乙酰輔酶A生成檸檬酸，再經TCA循環氧化為L-蘋果酸，如果乙酰輔酶A經丙酮酸脫氫酶產生，且草酰乙酸經丙酮酸羧化酶形成，則經該途徑1分子葡萄糖合成L-蘋果酸需釋放2分子CO2，其最大理論轉化率僅為1mol蘋果酸/mol葡萄糖；（C）另一L-蘋果酸合成的氧化途徑是利用加入乙醛酸循環的2分子乙酰輔酶A合成L-蘋果酸，其最大理論轉化率為1mol蘋果酸/mol葡萄糖；（D）第四種途徑是非循環型的，丙酮酸羧化為草酰乙酸，再經乙醛酸循環形成L-蘋果酸，其最大理論轉化率為1.33mol蘋果酸/mol葡萄糖；（E）經蘋果酸酶催化丙酮酸合成L-蘋果酸（EC 1.1.1.38-40，本文暫將該酶稱為蘋果酸酶，以區別于催化草酰乙酸底物的蘋果酸脫氫酶），其最大理論轉化率為2mol蘋果酸/mol葡萄糖。

經圖2中B、C、D方式積累L-蘋果酸的代謝途徑長，涉及的中間產物較多，導致L-蘋果酸積累效率低。蘋果酸脫氫酶具有較高的催化效率，可將進入TCA循環的草酰乙酸一步轉化為L-蘋果酸（圖2A），目前多數研究利用這一途徑來發酵合成L-蘋果酸，并獲得了較高的產量。此外，蘋果酸酶可將糖酵解途徑產物丙酮酸一步轉化為L-蘋果酸（圖2E），代謝途徑更為簡潔，然而自然界中存在的蘋果酸酶催化合成L-蘋果酸方向反應的效率低，目前僅有結合還原力再生過程利用該酶在體外合成L-蘋果酸的報道［22-24］。

圖1　微生物經葡萄糖合成L-蘋果酸的主要代謝途徑Fig.1　Key enzymatic reactions for L-malate production in microorganisms using glucose as carbon source

注：基因及相應酶：ptsG，葡萄糖磷酸轉移酶；ppc，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；pck，磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶；pyc，丙酮酸羧化酶（L.lactis）；maeA，NAD-依賴型蘋果酸酶；maeB，NADP-依賴型蘋果酸酶；mdh，蘋果酸脫氫酶；aceA，異檸檬酸裂解酶；aceB，蘋果酸合酶A；fumABCD，延胡索酸水合酶；frdABCD，延胡索酸還原酶；pps，磷酸烯醇式丙酮酸合酶；pfl，丙酮酸甲酸裂解酶；pdh，丙酮酸脫氫酶；ldhA，發酵型D-乳酸脫氫酶；poxB，丙酮酸氧化酶；acs，乙酰輔酶A合成酶；pta，磷酸轉乙酰酶；ackA，乙酸激酶；adhE，乙醇脫氫酶。

圖2　幾種潛在的L-蘋果酸合成代謝途徑的總結［20］Fig.2　Summary of several possible pathways for L-malate synthesis

2　強化L-蘋果酸合成代謝途徑

2.1強化前體草酰乙酸的合成途徑

糖酵解途徑產生的三碳化合物固定CO2羧化為草酰乙酸，是L-蘋果酸合成過程的瓶頸步驟。這一過程可由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK）或丙酮酸羧化酶（PYC）催化（圖1）。

代謝流分析表明增加PPC途徑流量可促進L-蘋果酸的合成［15］。由于PPC途徑不積累ATP，導致磷酸烯醇式丙酮酸高能磷酸鍵的浪費，而PCK在羧化合成草酰乙酸的同時積累ATP，PCK途徑的強化對于L-蘋果酸合成代謝過程更有利。然而，PCK同時可催化逆向反應，Escherichia coli自身PCK主要催化草酰乙酸為底物形成磷酸烯醇式丙酮酸方向的反應。Moon等［15］在刪除pta基因的E.coli中表達了來源于Mannheimia succiniciproducens的PCK酶，該酶主要催化形成草酰乙酸方向的反應，使得L-蘋果酸合成量提高到9.25g/L（出發菌株發酵液中不能檢測到L-蘋果酸）。應用PYC酶同樣可提高蘋果酸下游產物琥珀酸的合成水平［25］，但未見應用該酶提高蘋果酸產量的報道。

2.2強化蘋果酸脫氫酶途徑

成酸蘋果酸脫氫酶催化草酰乙酸合成L-蘋果酸，是蘋果酸合成途徑的關鍵酶，近年來研究者們嘗試對其進行高效表達，促進了L-蘋果酸的合成。

Pines等［19，26］發現了存在于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）胞質中的蘋果酸脫氫酶。通過高效表達該酶，可將細胞質中糖酵解途徑和丙酮酸羧化酶產生的草酰乙酸直接轉化為L-蘋果酸，不需進入線粒體來合成L-蘋果酸。與出發菌株相比，L-蘋果酸積累量提高了3.7倍，達到11.8g/L。

吳亞斌等［18］在敲除了副產物合成代謝途徑的E.coli菌株中，克隆表達了黃曲霉來源的蘋果酸脫氫酶基因，并優化了基因拷貝數。表明與用高拷貝質粒相比，較低的蘋果酸脫氫酶基因拷貝量可更有效促進L-蘋果酸的積累，將該基因整合于重組大腸桿菌的染色體上，L-蘋果酸的轉化率提高了15.7%，達到60.3%，產量達到14g/L，生產強度達到0.47g/（L·h）。

近年來，研究者還發現了其他來源的蘋果酸脫氫酶，并對其進行了深入研究。例如，從Streptomyces coelicolor A3（2）和Streptomyces avermitilis來源的蘋果酸脫氫酶，可高效、高專一性地催化NAD+為輔酶的草酰乙酸還原反應，其逆向反應速率低，且該酶熱穩定性好［27-28］。這也為強化L-蘋果酸合成代謝途徑提供了可能。

2.3同時強化草酰乙酸前體的合成途徑和蘋果酸脫氫酶途徑

由于Bacillus subtilis中分解蘋果酸的富馬酸酶（fumC編碼），在厭氧條件下活性遠低于好氧條件，且該菌株溶劑耐受性強，因此B.subtilis是較有潛力的L-蘋果酸生產菌株。首先對其改造，進行L-蘋果酸合成的是Mu等研究者［21］。他們在B.subtilis中同時表達了來源于E.coli的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PPC）和來源于S.cerevisiae的蘋果酸脫氫酶（MDH），使L-蘋果酸積累量提高為6.04mmol/L（野生型菌株不能積累L-蘋果酸）。進一步在乳酸合成途徑敲除的重組B. subtilis中表達這兩個酶，L-蘋果酸的積累量提高為9.18mmol/L，經微好氧-厭氧兩階段發酵，產量可達15.65mmol/L。

Zelle等［20］以耐糖S.cerevisiae為出發菌株，過量表達自身丙酮酸羧化酶（PYC），并通過敲除C端的過氧化物酶體定位序列來高水平表達胞質蘋果酸脫氫酶（MDH3），使得L-蘋果酸合成水平顯著提高。進一步過量表達Schizosaccharomyces pombe來源的蘋果酸運轉蛋白（SpMAE1），結果L-蘋果酸的產量大幅度提高至59g/L，其轉化率達到0.42mol蘋果酸/mol葡萄糖。經發酵罐優化后，L-蘋果酸轉化率提高至0.48mol蘋果酸/mol葡萄糖［29］，是目前以重組S.cerevisiae菌株合成L-蘋果酸的最高產量。Chen等［30］應用相同的策略，表達Rhizopus oryzae來源的RoMDH、RoPYC以及SpMAE1，可將酵母菌株Torulopsis glabrata L-蘋果酸的合成量提高為8.5g/L。

3　刪除副產物合成代謝途徑

大腸桿菌遺傳背景清晰，是進行代謝途徑研究的重要菌株。在厭氧條件下（尤其是在基本培養基中），E.coli發酵碳源合成還原型產物，以達到氧化還原平衡，乳酸、乙酸、琥珀酸、甲酸、乙醇是其主要代謝產物［31］。野生型E.coli發酵液中通常不積累L-蘋果酸，因此構建L-蘋果酸合成重組菌株，需將這些副產物合成途徑刪除，將代謝流引向L-蘋果酸的合成。

Ingram課題組對E.coli代謝途徑進行了系統、深入的研究，構建了利用草酰乙酸還原反應途徑來高效合成L-蘋果酸的重組E.coli。首先在構建琥珀酸合成重組E.coli時，他們發現了可積累高水平的L-蘋果酸的菌株［17］。在野生型E.coli C菌株中，敲除副產物乳酸（ldhA、mgsA）、乙酸（ackA）、甲酸（pflB、focA）、乙醇（adhE）的合成或運輸有關途徑的編碼基因，并經代謝進化（連續傳代培養，篩選生長速度快、產物合成量提高的菌株），所獲得的菌株KJ073利用100g/L葡萄糖，積累280mmol/L琥珀酸以及少量的丙酮酸和乙酸副產物，同時可積累高達516mmol/L L-蘋果酸，是極有潛力的L-蘋果酸代謝工程出發菌株。進一步對琥珀酸等副產物代謝途徑進行敲除，構建專一性合成L-蘋果酸重組菌株［16］。在琥珀酸合成重組E.coli KJ073（KJ071 ΔpoxB）菌株中，考察單一代謝途徑敲除對L-蘋果酸和副產物琥珀酸積累量的影響。結果表明，刪除富馬酸合成途徑（fumB和fumAC）或琥珀酸合成途徑（frdBC），都導致L-蘋果酸顯著積累（相同條件下，出發菌株不能積累L-蘋果酸），同時琥珀酸合成水平降低90%及以上。而天冬氨酸代謝相關途徑（aspA、aspC）和乙醛酸循環關鍵途徑（aceA）的刪除對L-蘋果酸的積累無顯著影響。在XZ316菌株（KJ073 ΔfrdBC）基礎上，疊加敲除副產物合成代謝途徑。結果表明，刪除蘋果酸酶編碼基因sfcA（即maeA），L-蘋果酸合成量提高為70mmol/L，細胞得率也提高了20%。進一步敲除maeB基因，導致L-蘋果酸積累量下降為40mmol/L，而L-蘋果酸對葡萄糖的轉化率有所增加，副產物丙酮酸的合成量幾乎被去除。在此基礎上，再敲除fumB和fumAC基因，最終獲得XZ658菌株，使得L-蘋果酸積累量提高了4倍。然而，XZ658菌株乳酸的積累量顯著增加，進一步期望通過刪除pykA和pykB基因來減少乳酸前體物質丙酮酸的供應量，然而相應重組菌株在乳酸積累量降低的同時，L-蘋果酸積累量也顯著降低。對XZ658菌株發酵條件進行優化，經好氧-厭氧兩階段發酵（添加碳酸氫鹽來提供CO2），可合成253mmol/L L-蘋果酸，其轉化率為1.42mol蘋果酸/mol葡萄糖，厭氧階段L-蘋果酸合成速率達到0.47g/L·h，僅合成極低濃度的乳酸，該結果是目前用重組大腸桿菌進行L-蘋果酸合成報道中最高產量。他們的研究表明，在該菌株中固定CO2的關鍵途徑是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PCK［32］，這也為后人研究提供了借鑒。

此外，fumA基因編碼的富馬酸酶，主要負責有氧條件下TCA循環的運行［33］，該基因的刪除導致E.coli重組菌株好氧生長受到嚴重影響，最終導致發酵周期顯著延長。而僅對該途徑中FUMB（厭氧條件下轉化蘋果酸為富馬酸）和FUMC（有氧、厭氧下都可作用，在脅迫環境下可代替FUMA）途徑進行敲除，可以避免對菌體生長的顯著影響，有利于縮短發酵周期［18］。這一結論也是對E.coli代謝工程合成L-蘋果酸的有益補充。

表1　L-蘋果酸生產性能的比較Table 1　Comparison of L-malate production properties

在S.cerevisiae中，Oba等［34］發現，硫胺素——丙酮酸消耗途徑PYC和丙酮酸脫氫酶（PDH）的輔酶，其合成途徑（如THI4和SNZ2）基因表達下調使得L-蘋果酸積累量增加。Nakayama等［35］也發現，呼吸缺陷型S.cerevisiae菌株，其L-蘋果酸合成量是野生型菌株的2.5倍。進一步通過紫外誘變，篩選抗呼吸抑制劑2，4-二硝基酚（DNP）的S.cerevisiae，獲得了L-蘋果酸積累量提高的突變株，其線粒體活性低，增大了糖酵解途徑（存在于細胞質中）產生的丙酮酸在胞質中轉化為L-蘋果酸的可能性，同時增加了胞內NADH/NAD+的比例，可能導致L-蘋果酸積累量提高［36］，也為后續L-蘋果酸代謝工程酵母菌株的構建提供了借鑒。

4　還原力再生策略

副產物代謝途徑的刪除導致丙酮酸積累，且糖酵解途徑產生的還原型輔酶積累。以NAD（P）+為輔酶的蘋果酸酶可催化丙酮酸羧化合成L-蘋果酸：丙酮酸+NAD（P）H+CO2→蘋果酸+NAD（P）+，是最簡潔的L-蘋果酸合成途徑。然而，從熱動力學角度看該反應過程難以進行（ΔGo’=+7.3kJ/mol）［37］，已發現的蘋果酸酶都催化蘋果酸與丙酮酸之間的可逆反應，其主要產物是丙酮酸。

Yoko等［22］在蘋果酸酶（Pseudomonase diminuta IFO 13182來源）反應體系中添加了葡萄糖-6磷酸脫氫酶（Leuconostoc mesenteroides來源），該酶氧化葡萄糖-6磷酸產生葡萄糖-6磷酸內酯和NADH，可實現輔酶的再生，在體外構建的耦合反應途徑可將丙酮酸底物轉化生成38mmol/L L-蘋果酸，其摩爾轉化率可達38%。進一步通過電化學的方式進行NADH的再生，同樣可實現L-蘋果酸酶（來源于Brevundimonas diminuta）羧化丙酮酸合成L-蘋果酸［23］。表明通過促進NAD（P）H的形成，可推動反應向L-蘋果酸合成方向進行。

Ye等［24］克隆表達了由葡萄糖合成L-蘋果酸代謝途徑中的各種酶，在體外進行L-蘋果酸的人工合成（synthetic metabolic engineering）?？寺×藖碓从赥hermococcus kodakarensis菌株的蘋果酸酶（TkME）基因，該酶以NADP+為輔酶，可逆催化丙酮酸和L-蘋果酸之間反應的羧化酶。為了降低這一逆向反應，他們耦合了一個熱穩定的糖酵解途徑，使整個途徑ATP及還原力NADP+的消耗和再生相平衡，將整個反應引向L-蘋果酸的合成（glucose+2HCO3-+2H→2malate+ 2H2O）。由于TkME還具有催化丙酮酸還原合成副產物乳酸的活性，通過提高HCO3-的濃度，可加強羧化反應，專一性合成L-蘋果酸，最終葡萄糖合成L-蘋果酸的摩爾得率可達到60%，最高可合成2.6mmol/L L-蘋果酸。這種體外合成的方法避免了轉錄和翻譯調控過程，可方便地通過改變酶的添加量來優化反應過程，去除了菌體生長和副產物合成過程，節約了碳源，可獲得更純產物，同時也為改造微生物體內代謝途徑進行L-蘋果酸合成提供了依據。然而，該方法尚存在產物合成量低、酶易熱失活、成本較高等問題，暫時不適用于L-蘋果酸的大規模生產。

Stols等［38］發現，在重組E.coli（Δpfl，ΔldhA）中，高效表達以NAD+為輔酶的蘋果酸酶（maeA），可提高蘋果酸下游產物琥珀酸的積累量。Kwon等［39］在E.coli K12菌株中，過量表達以NADP+為輔酶的蘋果酸酶（maeB），也可提高C4代謝產物尤其是琥珀酸的合成水平。因此，在還原型輔酶高度積累且蘋果酸分解代謝途徑受阻的重組菌株中，高效表達蘋果酸酶也有可能提高體內L-蘋果酸的積累量，而目前尚未見有關報道。

5　展望

目前，代謝工程重組菌株的L-蘋果酸產量仍顯著低于傳統黃曲霉發酵（113g/L［40-41］），同時也明顯低于乳酸、琥珀酸等其他代謝工程有機酸的產量。因此，利用代謝工程策略進行L-蘋果酸合成還有很大的研究空間和提升空間?？蓮囊韵聨讉€方面開展：

5.1L-蘋果酸合成代謝途徑的強化

糖酵解途徑產生的C3中間產物需固定1分子CO2，形成C4代謝產物，而研究表明這一過程通常效率較低，是蘋果酸積累的關鍵步驟。此外，蘋果酸脫氫酶和蘋果酸酶催化的反應都可逆向進行，催化效率低。更高效的羧化途徑和L-蘋果酸合成途徑的發現，將促進L-蘋果酸產量的提高。

5.2分解代謝途徑的調控

代謝途徑中間代謝產物往往涉及多條分解代謝途徑，將這些代謝途徑完全切斷（堵），會導致細胞生理缺陷甚至死亡。L-蘋果酸正是這樣一種TCA循環中間產物，利用組學分析技術對L-蘋果酸代謝途徑和調控機理進行更深入的解析，從而精簡這些分解代謝途徑，或利用基因開關［42-44］對關鍵代謝途徑進行調控，將有助于L-蘋果酸產量的提高和發酵工藝的改善。

5.3還原力再生途徑的強化

目前，通過增強還原型輔酶的供給量來促進L-蘋果酸的合成僅有在體外研究的報道。在微生物體內應用這一策略，也有望促進L-蘋果酸的積累。

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進口食品的中文標簽水很深 消費者購買前一定要看仔細

近年來，進口食品越來越受到消費者的熱捧，看著美劇、喝著咖啡、抱著零食成為很多消費者休閑的常態。不過目前市面上涌現出許多無中文標簽的所謂的“進口食品”，加之，消費者對“進口食品”的認識又知之甚少。對此，業內人士表示，沒有中文標簽的進口食品大多為不正規渠道來源，抑或是假冒偽劣產品，消費者在購買進口食品時，一定要看清外包裝是否有中文標簽，沒有中文標簽的要謹慎購買。

李女士近日在一家零食店內購買了一袋泰國零食，但食品包裝袋上沒有中文標簽，“英文勉強能看懂，可包裝上的泰文是什么意思呢？真的是花花綠綠的泰文，我也看不懂，生產日期、保質期，這些都沒有中文說明。我當時買的時候只是看了貨架上的中文標簽，上面注明了產品名稱和產地，當時并沒有注意包裝上有沒有中文標簽。”

無獨有偶，還有一名消費者吳先生也購買了無中文標簽的進口食品，“我是在網上買的這些餅干，當時只是簡單看了看網頁上對于這款餅干的介紹，但是沒有認真仔細查看一下包裝。所以在收到貨物后，才發現原來餅干的外包裝上一個中文字都沒有，全都是韓文，想上網查都不知道怎么查。而且家里人也不敢吃了，一點兒中文都沒有，吃著這種食物也挺不放心的。”吳先生說。

在杭州一些大型超市的進口食品專區，記者調查發現這些食品都貼有中文標簽，標注有品名、產地、成分及在中國的總經銷商的名稱和地址等信息。記者詢問了超市內的一名工作人員，工作人員稱，“這些都是硬性規定，必須貼上中文標簽才能賣。幾乎沒有人會來問我們有關進口食品的問題，因為中文標簽上都寫得很明白了，他們完全可以自行挑選。”

根據我國《預包裝食品標簽通則》的有關規定，進口食品必須貼上中文標簽才能上架。如果食品沒有任何中文標簽，大多不是正規渠道來源，沒有經過相關部門監管，其質量難以保障，也有可能是假冒偽劣產品，盡量不要購買。特別要提醒消費者的是：外包裝上的中文標簽上必須體現的信息包括食品名稱、配料表、日期標示、貯存條件、原產國國名或地區區名以及在中國依法登記注冊的代理商、地址和聯系方式等。消費者在購買時也要盡量選擇信譽好、經營規范的大型商場、超市，一旦發現食品的包裝袋沒有中文標簽，最好謹慎購買。

摘自每日商報

Advance in L-malate production based on metabolic engineering strategies

ZHOU Li，CUI Wen-jing，LIU Zhong-mei，ZHOU Zhe-min*
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

L-Malate was widely used in food，pharmaceutical and chemical industries.It was industrially produced using chemical or enzymatic method with petroleum derived resource as substrate.With reduction in oil resources，interest in the production of L-malate by microbial fermentation had been renewed.In recent years，metabolic engineering strategies have been applied to achieve L-malate production in Escherichia coli and yeasts etc.，which showed certain application prospect.Meanwhile，L-malate synthesis by constructing metabolic pathways in vitro with synthetic metabolic engineering had high theoretical value.This paper summarized metabolic routes for L-malate synthesis in microorganisms.Thereafter，metabolic engineering strategies for L-malate production including enhancement of L-malate synthesis pathway，deletion of byproduct accumulation routes and improvement of redox-power regeneration were reviewed to systemically explain the progress in metabolic mechanism of L-malate.Finally，further research areas in metabolically engineered L-malate production were proposed.

L-malate；metabolic engineering；microbial fermentation；reducing power regeneration

TS201.1

A

1002-0306（2015）10-0383-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.073

2014－09－12

周麗（1982-），女，博士，講師，研究方向：工業微生物。

周哲敏（1968-），男，博士，教授，研究方向：酶學與酶工程。

國家自然科學基金（31300087）；江蘇省自然科學基金（BK20130131）；江南大學自主科研課題（JUSRP1004）。