生香酵母C42真空冷凍干燥保護劑的篩選和優化

任蓓蕾，李志輝，田洪濤，杜萍萍，張瑩瑩，馬　雯，鎖　然，何俊萍，檀建新

（河北農業大學食品科技學院，河北省農產品加工工程技術中心，河北保定071000）

生香酵母C42真空冷凍干燥保護劑的篩選和優化

任蓓蕾，李志輝，田洪濤，杜萍萍，張瑩瑩，馬雯，鎖然，何俊萍，檀建新*

（河北農業大學食品科技學院，河北省農產品加工工程技術中心，河北保定071000）

為了獲得生香酵母C42的冷凍干燥保護劑，應用Plackett-Burman（PB）、最陡爬坡和Box-Benhnken（BBD）三種實驗設計法對真空冷凍干燥制備生香酵母C42活性干酵母的保護劑進行了優化。結果表明最優的保護劑配方為：2.90%甘油，10.33%棉籽糖，9.63%谷氨酸鈉，所得酵母菌的存活率為80.56%±1.19%，為該菌種的保存和后續研究應用打下堅實基礎。

生香酵母，冷凍干燥，響應面法，保護劑

高活性干酵母是一種結合生物工程、酵母產業和干燥應用技術發展起來的高科技、高效能產品，具有含水量低，易于運輸保存，發酵性能好，穩定性高的優點［1］。現代活性干酵母的研究主要集中在生物工程酵母菌的構建、發酵動力學研究和AADY技術的研究三個方面。最初的菌株篩選是從自然界中直接篩選目標菌株。現代酵母工業中，更多的研究集中在采用生物工程改造技術選育出專一性強、發酵力高的釀酒酵母新品種。然后利用干燥技術制備成高活性干酵母用于生產。為防止酵母菌受到危害，干燥過程中常加入一定的保護劑。為了獲得好的保護效果，需要進行科學的實驗設計，首先查閱文獻獲得能影響酵母生物量的保護劑組分，然后采用Plackett-Burman（PB）實驗設計，從中選擇出主要的因素，并對主要的因素進行單因素實驗（最陡爬坡實驗），再采用Box-Behnken（BBD）進行實驗，對實驗結果進行分析，得到最優的實驗結果［1-3］。

生香酵母是一類在發酵過程中能產生使人愉悅的香味物質的酵母菌的統稱。其在發酵過程中能夠合成多種物質如酯、酸、高級醇和醛等產物，對調味品和酒的風味、質地和色澤的形成起到重要的作用［4-6］。本課題組前期工作篩選到一株產乙酸乙酯能力較為突出的酵母菌，鑒定并命名為異常威克漢遜酵母（Wickerhamomyces anomalus）C42，具有較強的潛在應用價值［7-8］。本文利用PB、最陡爬坡實驗和BBD探討了該酵母菌真空冷凍干燥過程中保護劑的添加種類和添加量，得到了最優的保護劑配方和真空冷凍干燥工藝，為該菌種的保存及生產提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與設備

異常維克漢姆酵母C42（Wickerhamomycesanomalus C42） 河北農業大學食品科技學院微生物實驗室保存；除蜂蜜外，甘油、棉籽糖、吐溫80、蔗糖、谷氨酸鈉、VC、木糖醇及其他試劑均為分析純，北京化學試劑公司、Sigma公司；麥芽汁河北省保定市生力啤酒廠；麥芽汁液體培養基115℃，15min滅菌備用。

SW-CJ-ID型單人凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司；MJX-250B-Z型霉菌培養箱上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SIGMA-3K15型離心機德國；FD-1型冷凍干燥機北京博醫康技術公司；TU-1810型紫外可見光分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；MDF-U32V型超低溫冰箱日本SANYO公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種生長曲線的測定挑取適量斜面保存的生香酵母C42，接種到麥芽汁液體培養基中，30℃，200r/min振蕩培養24h活化。然后按1%接種量接種到麥芽汁液體培養基中，30℃，200r/min振蕩培養，每隔2h取培養液，在560nm波長處測定菌液的吸光值［9］，重復測三次，取平均值。

1.2.2菌體離心條件的確定選擇適宜的離心條件不但能使菌體的存活率達到最大，還能保留菌體的活性。實驗中設計不同的離心速率和時間（見表1）優化C42菌體收集的離心條件（離心溫度設定為-4℃）［10-11］。并采用稀釋涂布法計算離心前后C42的活菌數，計算離心存活率如下：

式（1）中，Rc為存活率；Nt為沉淀中的活菌數；N0為初始活菌數。

表1　離心條件的因素和水平Table 1　Factors and levels of centrifugation condition

1.2.3冷凍干燥保護劑的篩選及驗證

1.2.3.1PB實驗離心收集C42菌體，以預實驗優化獲得的10%脫脂乳為支撐底物，-80℃預凍3h，進行真空冷凍干燥［12-13］。采用稀釋涂布法分別計算凍干前后C42的活菌數，計算凍干存活率。

式（2）中，Rc為存活率；Ct為冷凍干燥后的活菌數；C0為冷凍干燥前的活菌數。

對其中凍干過程中的8種保護劑進行Plackett-Burman（PB）篩選（如表2）［7-8，14-16］。響應變量為C42的存活率，共進行12次實驗，每個實驗重復3次。

1.2.3.2最陡爬坡實驗按照PB實驗結果篩選出對該酵母菌株冷凍干燥過程的保護效應影響最顯著的三個因素，參照文獻［15，17］設計最陡爬坡實驗，逼近響應面的最佳值區域。

1.2.3.3BBD實驗在PB實驗和最陡爬坡實驗基礎上，設計BBD實驗方案（表3），對三個影響顯著的保護劑的添加量進行優化。每個實驗重復3次。

根據BBD優化的實驗條件進行驗證實驗。重復3次。

1.2.4數據處理與統計分析實驗根據Box-Benhnken模型的中心組合原理，主要采用Design-Expert 8.0.6（Stat-Ease Inc.，Min-neapolis，MN.USA）中Plackett-Burman（PB）、Central Composite Design（CCD）、Box-BehnkenDesign（BBD）進行實驗設計、數據分析及模型的建立。每個實驗處理3次重復，差異顯著性水平為0.01和0.05。

表2　Plackett-Burman實驗因素和水平Table 2　Range of different factors investigated with Plackett-Burman

表3　Box-Benhnken Design實驗因素與水平表Table 3　Factors and levels of Box-Benhnken Design

2　結果與分析

2.1菌種生長曲線的繪制

圖1　酵母菌C42的生長曲線Fig.1　Growth curve of yeast strain

圖1為生香酵母C42的生長曲線圖，由圖1可知，菌株C42在麥芽汁液體培養基中培養4h后開始進入對數生長期，至18～20h時趨于穩定，進入穩定期。考慮到冷凍干燥時，菌株的生物量及活性，選擇對數末期穩定初期進行菌體的離心收集，即18～20h最為適宜。

表4　Plackett-Burman design實驗結果（N=12）Table 4　Response values of Plackett-Burman design（N=12）

2.2離心條件的確定

圖2　離心條件對酵母菌C42存活率的影響Fig.2　Effect of centrifugation condition on the survival of C42

離心條件對酵母存活率有一定影響。實驗中選定3個離心速率，3個離心時間，對比離心后菌體存活率的影響，結果如圖2所示，在4500r/min的離心條件下離心20min時C42的存活率最高，達到95.5%。因此菌體最適離心收集條件為4500r/min，20min。

2.3Plackett-Burman（PB）實驗設計結果

PB實驗結果和不同影響因子的效應分析見表4、表5。由表4和表5可知，對冷凍干燥后菌株C42存活率影響顯著的因素為甘油（p=0.0044）、棉籽糖（p= 0.0012）和谷氨酸鈉（p=0.0059）。因此選擇這3個因子作為影響菌株C42存活率的關鍵因素。而其他因子的p值均大于0.05，差異不顯著，故不作考慮。

2.4最陡爬坡實驗結果

根據PB實驗篩選出棉籽糖、谷氨酸鈉、甘油三個對提高酵母菌C42存活率影響顯著的因素，進行最陡爬坡實驗，實驗結果如表6所示。由表6可以看出，3%甘油、10%谷氨酸鈉、10%棉籽糖得到的酵母菌的存活率最高為63.70%。

2.5Box-BenhnkenDesign實驗設計結果

根據BBD實驗設計原理，設計3因素3水平的響應面分析實驗，得到的結果如表7所示。對表7的實驗結果進行多元回歸分析（表8），結果表明所選模型的F=100.39，p＜0.0001，說明不同處理間差異極顯著，可以認為所選用的二次回歸方程是適當的；R2=0.9923，說明因變量Y與全體變量之間的線性關系顯著，R2adj= 0.9824說明僅有1.76%的變異不能由該模型解釋。精密度為25.947，失擬項F=1.26，p=0.3988，差異不顯著，說明實驗預測值和實際值相吻合，實驗擬合性好，實驗誤差小。實驗根據模型得到優化后的回歸方程為：Y=78.05-4.85A+2.09B-2.55C+5.44AB+3.30AC+ 1.13BC-24.44A2-11.18B2-18.82C2

表5　不同影響因子的效應分析Table 5　The analyses of the significance of different factors

表6　最陡爬坡實驗設計及結果Table 6　Steepest ascent design and response values

根據表7和表8分析結果，作出雙因子相應的響應曲面如圖3～圖5所示。

圖3～圖5分別表示A：甘油與B：棉籽糖、A：甘油與C：谷氨酸鈉和B：棉籽糖與C：谷氨酸鈉對酵母菌存活率的影響的曲面圖，由三組圖可以看出響應曲面呈傘形，中心突起，說明兩因素之間的影響基本呈拋物線型關系，均有一個極大值點，變化趨勢都是先增大后減小。即存在適宜的甘油、棉籽糖、谷氨酸鈉的濃度使冷凍干燥后酵母菌的存活率達到最高。且AB、AC交互作用顯著，BC交互作用不顯著，與方差分析結果一致。

以上分析表明存在適宜的甘油、棉籽糖、谷氨酸鈉濃度有利于冷凍干燥過程中保護酵母菌存活率最大。用Design-Export 8.0.6軟件分析，得出最優實驗結果為：甘油濃度2.90%，棉籽糖濃度10.33%，谷氨酸鈉濃度9.63%。在此配方的保護作用下，得到模型的最大預測值為78.45%。

表7　Box-Benhnken Design實驗設計與結果Table 7　Box-Benhnken Design and response values

表8　Box-Benhnken Design實驗回歸模型方差分析Table 8　Analysis of variance on regression mode of Box-Benhnken design

圖3　A：甘油和B：棉籽糖相應的響應曲面圖Fig.3　Corresponding 3d surface of A-glycerin and B-raffinose

圖4　A：甘油和C：谷氨酸鈉相應的響應曲面圖Fig.4　Corresponding 3d surface of A-glycerin and C-sodium glutamate

按上述得到的最優工藝條件進行驗證實驗，得到冷凍干燥后的酵母菌存活率為80.56%±1.19%，接近預測值78.45%，且三組實驗結果差異較小，說明實驗結果有較好的重復性。因此可以說明該實驗應用響應面優化后得到的實驗方案可靠性較高。

3　討論

3.1真空冷凍干燥法

真空冷凍干燥法在低溫低壓下進行，使熱敏性成分保留下來不變性，菌種存活率高，而且干制品含水量很低，儲存期長，復水性好。該技術以其獨特的優越性越來越多的應用于生物及其他制品的干燥過程中。對于凍干酵母菌粉，也已經有報道：王華等利用凍干技術制備了熱帶假絲酵母活性干粉，其存活率達到82.73%［18］；西北農林科技大學的王雪鋒也是利用真空冷凍干燥技術制備了我國本土優良的釀酒酵母Saccharomyces cerevisia LFN518的活性干粉，其存活率達到80%以上［2］。如果能夠確定合理的凍干工藝，優化最佳保護劑配方，經擴大化實驗逐步實現大規模、連續化生產，其創造的價值將不可限量。

3.2脫脂乳濃度的影響

在冷凍干燥過程中，保護劑主要有兩個功能：一是作為載體材料和復水受體，提供具有一定物理結構的干燥后殘余物；二是在冷凍和干燥過程中保護細胞不受損害。脫脂乳作為最常用的微生物菌體優良保護劑之一，已得到廣泛的應用，在冷凍干燥過程中，它能作為支架物質，形成一種輕而多孔的結構，使干燥后容易復水，而且能夠保持其他物質的性能。因此，無論是單獨使用或者與其他物質混合使用，脫脂乳都能起到很好的保護效果［13］。因此，本文根據預實驗結果選擇脫脂乳濃度為10%作為后續保護劑的篩選基礎。

3.3保護劑的優化

在酵母菌干燥的過程中添加保護劑是有效提高酵母菌存活率和性能的最佳方法之一。關于凍干保護劑的保護機理普遍接受的有3種假說：優先替代假說；水替代假說；玻璃態假說。三種假說都在一定程度上說明保護劑保護機理的某些特性。因此，根據不同的假說說明的保護劑機理，凍干保護劑被分為幾類：碳水化合物類、聚合物類、蛋白質類、氨基酸類和其他類保護劑。目前常用的保護劑主要有海藻糖、蔗糖、葡萄糖、棉籽糖、二甲基亞砜、甘油、脫脂乳粉等［19］。本實驗中選用8種常用的保護劑種類通過響應面法優化出了生香酵母C42最適的冷凍干燥保護劑配方，制備出了符合國家標準，且不明顯低于其他方法制備的活性干酵母存活率。因此，可用于對酵母菌的保存和后續實驗的研究。

4　結論

研究了生香酵母C42菌體收集的最佳時間為18～20h，離心收集條件為速率4500r/min，時間20min，并以脫脂乳為支架物質研究了8種保護因素，篩選出了影響最顯著的三個因素分別為甘油、棉籽糖、谷氨酸鈉。以C42的存活率為響應值Y，通過BBD實驗，建立了模型的回歸方程，得出優化后的最佳實驗方案為：10%脫脂乳，2.90%甘油，10.33%棉籽糖，9.63%谷氨酸鈉。在此條件下，冷凍干燥后酵母菌的存活率為80.56%±1.19%。

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Screening and optimization of vacuum freeze-drying protective agent formula for an aroma-producing yeast strain C42

REN Bei-lei，LI Zhi-hui，TIAN Hong-tao，DU Ping-ping，ZHANG Ying-ying，MA Wen，SUO Ran，HE Jun-ping，TAN Jian-xin*
（Agricultural University of Hebei，College of Food Science and Technology，Baoding 071000，China）

To obtain the vacuum freeze-drying protective agents for an aroma-producing yeast strain C42，Plackett-Burman（PB），the steepest ascent experiment and BBD were used to screen the protective agent formula by vacuum freeze-drying method.As a result，the survival rate of aroma-producing yeast strain C42 was 80.56%±1.19%under the optimal freeze-drying conditions which consisted of 2.90%of glycerin，10.33% of raffinose and 9.63%sodium glutamate，which laid a firm foundation for preservation，the further research and application of the yeast strain C42.

aroma-producing yeast；freeze-drying；response surface method；protective agents

TS201.1

A

1002-0306（2015）10-0158-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.024

2014－07－07

任蓓蕾（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學。

檀建新（1968-），男，博士，教授，研究方向：微生物資源開發與利用。

國家農業科技成果轉化基金（2012GB2A200030）；國家自然基金（31171725，31071494）。