新疆野生蘋果（Malus sieversii）的總多酚、總黃酮提取物的抗氧化活性研究

陳志娜，師俊玲，王繼勛

（1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100；2.西北工業(yè)大學生命科學學院，陜西西安710072；3.新疆農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所，新疆烏魯木齊830091）

新疆野生蘋果（Malus sieversii）的總多酚、總黃酮提取物的抗氧化活性研究

陳志娜1，師俊玲2，*，王繼勛3

（1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100；2.西北工業(yè)大學生命科學學院，陜西西安710072；3.新疆農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所，新疆烏魯木齊830091）

以采集于新疆不同地區(qū)的20個野生蘋果品種為研究對象，福林酚法測總多酚，分光光度計法測定總黃酮，DPPH、ABTS、還原能力法測定總抗氧化能力，相關(guān)系數(shù)法分析各個指標之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，不同品種的野生蘋果的總多酚、總黃酮及抗氧化活性之間具有顯著差異，其中，HDM-23的總多酚含量最高（4714.33μmol沒食子酸/100g鮮果），XY-31的總黃酮含量最高（2452.84mg蘆丁/100g鮮果）。總多酚、總黃酮及抗氧化活性之間呈極顯著（p＜0.01）正相關(guān)，表明總多酚與總黃酮是野生蘋果抗氧化活性的主要貢獻物質(zhì)。

野生蘋果（Malus sieversii），多酚，黃酮，抗氧化能力

野生蘋果（Malus sieversii［Ledeb.］Roem.）是栽培蘋果（Malus domestica Borkh）的起源，屬于第三紀孑遺物種［1］。長期的自然選擇使野生蘋果的環(huán)境適應能力及抗病性更強，如抗蘋果霉心病、抗吉丁蟲等［2］。因此，野生蘋果是抗逆蘋果育種的重要來源，而新疆西部山區(qū)盛產(chǎn)多種野生蘋果。

有研究表明，酚類化合物不僅與植物防御病原菌的機制有關(guān)（如Phytophthora sp.和Sclerotinia sclerotiorum），還有利于抵抗云杉食心蟲及冷熱刺激等［3-6］。另外，多酚化合物是水果中一種重要的抗氧化活性物質(zhì)［7-8］。目前，野生蘋果的遺傳多樣性已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)［9-11］。此外，野生蘋果葉子中的多酚成分與抗氧化活性也有了初步研究［12］。然而，不同地區(qū)不同品種的野生蘋果果實中的總多酚、總黃酮及其抗氧化活性的研究還鮮有報道。因此，本實驗以新疆不同地區(qū)不同品種的野生蘋果為研究對象，對基本理化指標、總多酚、總黃酮、抗氧化活性及其之間的相關(guān)性進行了研究，為其將來的應用提供基本的參考資料。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

二十種不同品種的野生蘋果（Malus sieversii） 9月中旬采集于新疆不同的地區(qū)，洗凈后-80℃下保存，樣品的采集地點、園藝化學指標見表1；2，2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽［2，2’-Azinobis（3-ethylbenzenothiazoline-6-sulphonic acid），ABTS］、水溶性維生素E（6-hydroxy-2，5，7，8-teramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、福林酚、1，1-二苯-2-苦基肼（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）均購于Sigma公司；沒食子酸（gallic acid）、蘆丁（rutin）均購買于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。

UVmini-1240紫外-可見分光光度計日本島津公司；HC-3018R高速冷凍離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司；BT25S電子天平賽多利科學儀器（北京）有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋上海森信實驗儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品處理樣品的提取方法參照Zhao和Hall［13］的方法略作修改。冷凍后的野生蘋果切塊，加入0.1%異VC，于研缽中充分研磨至均漿狀，精確稱取（2±0.005）g均漿于三角瓶中，加入100mL 80%（v/v）的乙醇，用塑料膜封口，超聲波提取30min后抽濾，收集濾液進行測定。實驗重復3次。

1.2.2基本化學指標可滴定酸的測定根據(jù)GB/ 12293-90；VC的測定參照GB/6195-1986；單寧的測定參照NY/T1600-2008；果膠的測定方法參照NY/T 2016-2011。

1.2.3野生蘋果總多酚含量的測定樣品中總多酚含量的測定采用福林酚法，參考Cai等［14］的方法，取0.8mL樣液于小試管中，加入0.2mol/L福林酚試劑1.0mL，搖勻后靜置反應5min，再加入7.5%（w/v）碳酸鈉溶液0.8mL，搖勻后置于25℃水浴中反應30min，765nm處測定吸光值。空白作對照調(diào)零，以沒食子酸為標準物質(zhì)制作標準曲線（0～150μmol/L），結(jié)果換算成每克鮮果相對于沒食子酸的量（μmol沒食子酸/100g鮮果），實驗重復3次。標準曲線方程為Y=0.005X+ 0.0254，R2=0.9992。

1.2.4野生蘋果總黃酮含量的測定參考Sun等［15］的方法，略作修改。取5.0mL樣液于試管中，加入0.3mL 5%（w/v）亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置反應5min，再加入0.3mL 10%（w/v）三氯化鋁，搖勻后于25℃下水浴反應6min，再加入2mL 4%（w/v）氫氧化鈉，搖均后靜置反應10min，510nm下測定吸光值，空白作對照調(diào)零。以蘆丁為標準物質(zhì)制作標準曲線，結(jié)果換算成每克鮮果相當于蘆丁的量（mg蘆丁/100g鮮果），標準曲線方程為Y=0.0047X-0.0109，R2=0.9995。

表1　不同品種的野生蘋果的采集地點與品性Table 1　Sampling sites and characteristics of the collected wild apple varieties

1.2.5ABTS+·清除能力的測定參考Tai等［16］的方法，取7mmol/L ABTS溶液5mL，加入140mmol/L過硫酸鉀溶液88μL，室溫下避光放置12～16h，使用前用無水乙醇調(diào)零，在734nm處用無水乙醇將其吸光值調(diào)整至0.700±0.05，作為工作液備用。

取ABTS+·工作液3mL于試管中，加入樣液0.5mL，搖勻后置于25℃水浴避光反應30min，用無水乙醇調(diào)零，在734nm處測定吸光值。以水溶性維生素E（Trolox）為標準物質(zhì)制作標準曲線，結(jié)果換算為每克鮮果相當于Trolox的量（μmol Trolox/100g鮮果），標準曲線方程為Y=-0.004X+0.545，R2=0.9999。

1.2.6DPPH·清除能力的測定參考Vieira等［17］的方法，取6.0×10-5mol/L DPPH無水乙醇溶液0.5mL，加入3mL樣液，搖勻后置于25℃水浴避光反應30min，以蒸餾水調(diào)零，在517nm處測定吸光值。以Trolox為標準物質(zhì)制作標準曲線，結(jié)果換算為每克鮮果相當于Trolox的量（μmol Trolox/100g鮮果），標準曲線方程為Y=-0.0195X+0.8108，R2=0.9994。

1.2.7還原能力的測定參考Tai等［16］的方法，略作修改。取1.0mL樣液于試管中，加入0.2mol/L、pH6.6磷酸緩沖液2.5mL，再加入1.0%（w/v）鐵氰化鉀溶液2.5mL，搖勻置于25℃水浴反應20min后，迅速冷卻，并加入10.0%（w/v）三氯乙酸溶液2.5mL，搖勻，5000×g離心，取上清液2.5mL于干凈試管中，加入2.5mL蒸餾水，再加入0.5mL 0.1%三氯化鐵溶液，搖均后靜置10min，在710nm處測定吸光值。以抗壞血酸為標準物質(zhì)制作標準曲線，結(jié)果換算為每克鮮果相當于抗壞血酸的量（mg抗壞血酸/100g鮮果），標準曲線方程為Y=0.0077X+0.0838，R2=0.9993。

1.3數(shù)據(jù)處理

結(jié)果用3次平行實驗的平均值±標準差表示。使用SAS8.0軟件，采用ANOVA進行顯著性檢驗，選取p＜0.05為顯著水平。

表2　不同品種的野生蘋果的化學指標Table 2　Chemical characteristics of the collected wild apple varieties

2　結(jié)果與分析

2.1基本化學指標

20種野生蘋果的基本化學指標見表2。糖酸比是反映蘋果風味和感官特性的重要指標［18］，而實驗中的野生蘋果品種的糖酸比小于10，所以不適宜食用。Vieira等［19］曾經(jīng)報道糖酸比小于20的蘋果品種風味尖酸，適于后期加工或釀制蘋果酒。

2.2總多酚與總黃酮的含量

蘋果的品種、生長地不同以及不同的提取方法和抗氧化活性的測定方法都會影響其總多酚含量與抗氧化能力［19-22］。本實驗首次對采樣于中國新疆的不同品種的野生蘋果的主要成分和抗氧化活性進行綜合分析。

由圖1可知，不同品種的野生蘋果總多酚含量從（1419.33±178.98）μmol沒食子酸/100g鮮果到（4714.33± 223.92）μmol沒食子酸/100g鮮果，平均含量為2664.70μmol沒食子酸/100g鮮果。其中HDM-23中的總多酚含量最高，其次是XY-49，XY-58中的總多酚含量最低。Henriquez等［19，21］研究了智利5種栽培蘋果品種的總多酚含量，發(fā)現(xiàn)蘋果果皮中的多酚含量明顯高于果肉，其中蛇果品種的多酚含量最高，而實驗中的新疆野生蘋果總多酚的平均值是蛇果果皮中的3倍左右。據(jù)報道，植物的抗病性與其多酚含量有關(guān)，往往多酚含量越高抗病性越強［3-6］。因此，野生蘋果中的多酚含量較高可能與其所處的惡劣環(huán)境有關(guān)，如病害、蟲害、營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏等，這些刺激了多酚的積累［18］。

類黃酮是一類重要的酚類物質(zhì)，因為其對人類健康的重要作用而引起廣泛的關(guān)注［23］。由圖2可以看出，不同品種的野生蘋果總黃酮含量從（639.01±62.11）mg蘆丁/100g鮮果到（2452.84±22.15）mg蘆丁/ 100g鮮果，平均含量1093.25mg蘆丁/100g鮮果。其中XY-31中的總黃酮含量最高，其次是HDM-23，XY-39中的總黃酮含量最低。Vieira等［17］對三種栽培蘋果品種的總黃酮的研究表明，蘋果果皮中的總黃酮的含量要明顯高于果肉中的含量，而且，有研究表明果皮是蘋果生物活性最高的部分［24-25］。Petkovsek等［26］認為這些差異主要是因為果皮中的黃酮苷與高含量的兒茶素與綠原酸。因此，在野生蘋果的應用過程中，不能忽視對果皮的充分利用。

圖2　不同品種的野生蘋果中總黃酮的含量（n=3）Fig.2　Total flavonoid content of different wild apple varieties（n=3）

2.3抗氧化活性的測定

野生蘋果的抗氧化能力分別換算成了Trolox當量（μmol Trolox/100g鮮果）與抗壞血酸當量（mg抗壞血酸/100g鮮果）。圖3為不同品種野生蘋果提取物對ABTS+自由基清除的能力，圖4為不同品種野生蘋果提取物對DPPH·自由基清除的能力。

由圖3可知，不同品種的野生蘋果提取物對ABTS+·和DPPH·的清除能力存在顯著性差異。20種野生蘋果提取物對ABTS+·的清除能力從1872.22到5654.17μmol Trolox/100g鮮果，對DPPH·的清除能力從782.82到1919.15μmol Trolox/100g鮮果，平均值分別為3326.60μmol Trolox/100g鮮果和1283.09μmol Trolox/100g鮮果。因此，實驗中的野生蘋果提取物對ABTS+·的清除能力要明顯高于對DPPH·的清除能力。其中，XY-31、HDM-23和XY-49具有最強的清除ABTS+·和DPPH·的能力，XY-58清除ABTS+·的能力最弱，XY-16清除DPPH·的能力最弱。

圖3　不同品種的野生蘋果對ABTS+·自由基的清除能力（n=3）Fig.3　Antioxidant activity of twenty wild apple varieties measured by ABTS+·assay TEAC means Trolox equivalent antioxidant capacity（n=3）

圖4　不同品種的野生蘋果對DPPH·自由基的清除能力（n=3）Fig.4　Antioxidant activity of twenty wild apple varieties measured by DPPH·assay TEAC means Trolox equivalent antioxidant capacity（n=3）

由圖5可知，不同品種野生蘋果提取物對Fe3+到Fe2+的還原能力從145.78到1433.12mg抗壞血酸/100g鮮果。不同品種的野生蘋果提取物對Fe3+到Fe2+的還原能力具有顯著性差異，其中，XY-49對Fe3+到Fe2+的還原能力最高，XY-16對Fe3+到Fe2+的還原能力最弱，相差了近10倍。

2.4相關(guān)性分析

20種不同品種的野生蘋果之間滴定酸、總糖、VC、單寧、果膠、可溶性固形物、總多酚、總黃酮及抗氧化活性之間的相關(guān)性見表3。由表3可知，總多酚、總黃酮、ABTS+·與DPPH·4個指標兩兩之間極顯著（p＜0.01）正相關(guān)，而VC含量與ABTS+·與DPPH·之間沒有顯著相關(guān)性，表明總多酚與總黃酮是野生蘋果抗氧化活性的主要貢獻物質(zhì)。總糖和總多酚含量與還原能力相關(guān)，而總黃酮的含量與還原能力不相關(guān)。因此，野生蘋果提取物對Fe3+到Fe2+還原能力的主要貢獻物質(zhì)是總糖和總多酚。

表3　20種野生蘋果的滴定酸、總糖、VC、單寧、果膠、可溶性固形物、總多酚、總黃酮及抗氧化活性之間的相關(guān)性Table3　Correlation coefficients of titratable acidity，total sugar，vitamin C，tannic，pectin，total soluble solid，total polyphenol，total flavonoid，ABTS assay，DPPH·assay and reducing power assay of wild apple species

圖5　不同品種的野生蘋果的還原能力（n=3）

3　結(jié)論

本實驗研究了20種不同品種的野生蘋果滴定酸、總糖、VC、單寧、果膠、可溶性固形物、總多酚、總黃酮及抗氧化活性，及其之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)不同品種的野生蘋果的總多酚、總黃酮及抗氧化活性之間具有顯著地差異，其中HDM-23中的總多酚含量最高，為4714.33μmol沒食子酸/100g鮮果，明顯高于普通栽培品種；XY-31中的總黃酮含量最高，為2452.84mg蘆丁/100g鮮果。野生蘋果品種的糖酸比普遍小于10，所以不適宜食用，適于后期加工或釀制蘋果酒。

相關(guān)性分析顯示總多酚與ABTS+·和DPPH·之間的相關(guān)性系數(shù)達到了0.87和0.83，總黃酮與ABTS+·和DPPH·之間的相關(guān)性系數(shù)都是0.92，極顯著（p＜0.01）正相關(guān)，表明總多酚與總黃酮是野生蘋果抗氧化活性的主要貢獻物質(zhì)。

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Antioxidant activity of polyphenolics and flavonoid extracted from wild apple（Malus sieversii）

CHEN Zhi-na1，SHI Jun-ling2，*，WANG Ji-xun3
（1．College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling 712100，China；2．School of Life Sciences，Northwestern Polytechnical University，Xi’an 710072，China；3．Institute of Horticulture，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China）

Twenty different lines of wild apple（Malus sieversii）collected from different places in Xinjiang，China were used as research objects.Total total polyphenol content was measured using the Folin-Ciocalteau method.Total flavonoid content was measured by spectrophotometer.Total antioxidant capacities were analyzed by ABTS assay，DPPH assay，and iron（Ⅲ）to iron（Ⅱ）reducing power assay，and the correlation between the various indicators was measured with Pearson correlation coefficient.It was found that HDM-23 had the highest total polyphenol content（4714.33μmol gallic acid/100g fresh matter），and XY-31contained the highest amount of total flavonoid content（2452.84mg rutin/100g fresh matter）.The present study implied that total polyphenols contribute to the antioxidant properties of the wild apple（p＜0.01）and total flavonoid was an important phenolic compound in the wild apple varieties investigated.

wild apple（Malus sieversii）；polyphenol；flavonoid；antioxidant capacity

TS201.1

A

1002-0306（2015）10-0143-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.021

2014－07－21

陳志娜（1988-），女，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

師俊玲（1972-），女，教授，研究方向：生物技術(shù)。

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）研究專項（201003021）。