界面組成對乳化顆粒填充乳清蛋白凝膠強度及持水性的影響

程　宇，程　珂，李　歡，施海月，王　丹

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

界面組成對乳化顆粒填充乳清蛋白凝膠強度及持水性的影響

程宇，程珂，李歡，施海月，王丹

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

考察了pH（3、7）、氯化鈉濃度（50、200mmol/L）以及熱處理（90℃、30min）對不同乳化劑（乳清分離蛋白、Tween20、Tween20+馬鈴薯蛋白水解物）制備O/W乳狀液分層穩定性的影響。并以凝膠持水性和凝膠強度為指標，考察了pH和氯化鈉濃度對上述不同界面組成的乳化顆粒填充乳清蛋白熱誘導凝膠性質的影響。結果表明，以乳狀液為溶劑制備的凝膠持水性與凝膠強度高于以水為溶劑制備的凝膠。加入一定量的氯化鈉有助于乳狀液凝膠持水性與凝膠強度的增加。研究表明，pH和鹽濃度對乳狀液填充凝膠強度均有影響，乳狀液性質對乳狀液填充凝膠強度和持水性有一定影響。

乳清蛋白凝膠，乳狀液，持水性，凝膠強度

凝膠是介于液體和固體之間的軟物質［1］，并且有較好的持水性，可以給食品提供良好的質構和風味，因此廣泛存在于我們日常的食品中。蛋白凝膠是食品中主要的凝膠之一，如酸奶和法蘭克福香腸。普通蛋白凝膠的內部結構通常是空間網絡結構，網絡之間沒有支撐物，因此在受到外界因素影響的時候凝膠易于被破壞。同時，凝膠內部網絡間介質通常都是水，因而對脂溶性組分的包埋及承載能力較弱，使凝膠類產品的開發受到了一定限制。研究表明，如果在這些空間網絡結構里嵌入一定強度的顆粒如乳化脂肪，則有可能很大程度地提高凝膠的性質，改善蛋白凝膠類食品的品質［2-3］。乳化脂肪由于是球形顆粒，表面積較大，可以和凝膠網絡中的分子有較多的接觸，并且乳化脂肪顆粒表面的乳化劑分子可以和凝膠網絡分子間產生一定的相互作用，對凝膠性質有較大影響［4］。因此本研究擬以乳清蛋白凝膠為研究對象，選擇不同乳化劑制備的乳狀液作為乳清蛋白凝膠的填充劑，考察不同界面組成的乳化脂肪顆粒在不同環境條件（pH和氯化鈉濃度）下對乳清蛋白凝膠強度及持水性的影響，為開發基于乳清蛋白凝膠的新型食品提供一定依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

馬鈴薯濃縮蛋白荷蘭AVEBE BA，蛋白含量81%；乳清分離蛋白美國Hilmar公司，蛋白含量90%；Alcalase諾維信公司；福臨門大豆油當地超市購買；其他試劑上海國藥集團，分析純級；實驗用水為純水自制。

FE-20型pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；WCR-8型加熱制冷循環器、HG15A型高速乳化分散機大韓科學株式會社；TDL-5-A型離心機上海安亭科學儀器廠；Leica DMI4000B型熒光倒置顯微鏡德國徠卡儀器有限公司；TA-XT2i型物性質構儀英國Stable Micro Systems公司。

1.2實驗方法

1.2.1馬鈴薯蛋白水解物（PPH）的制備參考Wang等［5］的方法。將馬鈴薯濃縮蛋白溶液（4%，w/v）調pH到8.0左右，用Alcalase在50℃分別水解0.5h和6h，酶底比為1/100。水解結束后，用1mol/L的NaOH調pH至7.0，80℃滅酶15min，7000×g離心后取上清液冷凍干燥，得到0.5h和6h馬鈴薯蛋白水解物備用。

1.2.2不同乳化劑乳狀液的制備實驗分別采用乳清蛋白、Tween20以及Tween 20+馬鈴薯蛋白水解物（0.5h或6h）為乳化劑制備相應的乳狀液。乳狀液水相溶液：乳清蛋白溶液（1.125%，w/v，10mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0）、Tween 20（1.125%，w/w，10mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0）溶液以及溶有10mg/mL不同馬鈴薯蛋白水解物的Tween 20（1.125%，w/w，10mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0）溶液。將大豆油（10%，w/w）和水相溶液（90%，w/w）用高速乳化分散機在21，600r/min下乳化2min得到不同乳化劑的乳狀液。

1.2.3環境因素對乳狀液穩定性的影響

1.2.3.1pH對乳狀液穩定性的影響在乳狀液中添加一定量的NaCl固體使其濃度為50mmol/L，在此條件下考察不同乳化劑制備乳狀液在不同pH（3.0和7.0）下的穩定性，pH使用1mol/L鹽酸或1mol/L NaOH進行調節。

1.2.3.2NaCl濃度對乳狀液穩定性的影響在乳狀液中添加一定量的NaCl固體使其濃度為50、200mmol/L，在pH7條件下考察NaCl濃度對乳狀液穩定性的影響。

1.2.3.3熱處理對乳狀液穩定性的影響在pH7條件下，在乳狀液中添加一定量的NaCl固體使其濃度為50、200mmol/L，并將不同乳化劑制備的乳狀液在90℃加熱30min，考察熱處理對乳狀液穩定性的影響。

1.2.4乳狀液穩定性的測定乳狀液的穩定性通過靜置分層實驗來測定。將乳狀液倒入試管中，乳狀液高度（100mm）記為H0。在25℃下靜置24h后，觀察其分層現象，并記錄乳狀液上層乳脂層的高度Ht。

1.2.5乳狀液填充乳清蛋白凝膠的制備以不同乳化劑制備得到的乳狀液為溶劑，在磁力攪拌下分散乳清蛋白（12%，w/v）30min，用1mol/L鹽酸調或1mol/L NaOH調節pH。取5g分散好的乳清蛋白于平底玻璃試管中，在真空干燥箱內室溫下（真空度為0.08MPa）脫氣10min后包覆一層鋁箔紙封口，并在90℃水浴加熱30min使乳清蛋白形成凝膠。取出加熱后的試管置于裝有碎冰的泡沫盒中迅速冷卻到室溫，然后在4℃條件下貯藏24h后取出，在25℃下平衡2h用于凝膠強度及持水性的測定。

1.2.6環境因素對乳狀液填充乳清蛋白凝膠性質的影響

1.2.6.1pH對乳狀液填充乳清蛋白凝膠性質的影響

在NaCl濃度50mmol/L下考察不同乳化劑制備乳狀液在不同pH（3.0和7.0）下制備乳狀液填充凝膠的強度及持水性。

1.2.6.2NaCl濃度對乳狀液填充乳清蛋白凝膠性質的影響在pH7條件下，考察不同NaCl濃度（50、200mmol/L）時乳狀液凝膠的強度及持水性。

1.2.7凝膠強度的測定采用物性質構儀測定凝膠強度。選用直徑10mm的圓柱狀平頭壓縮探頭，設定測前速度1mm/s，測試速度0.5mm/s，測后速度1mm/s，下壓距離5mm，一次測定過程中探頭下壓兩次，第一次壓縮時的最大峰值為硬度。

1.2.8凝膠持水性的測定參照Wu等［2］的方法。在離心管內放入適量棉花后稱重，質量記為m1，然后將5g樣品裝入離心管在3000×g離心5min，離心后將樣品取出，再次稱取離心管及棉花的質量，質量記為m2。持水性計算公式如下：

1.2.9乳狀液微觀結構的顯微鏡觀察取2μL乳狀液樣品滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，并確保蓋玻片和載玻片中間沒有氣泡。將制備好的樣品放置在顯微鏡下觀察，找到有代表性的圖片后，用顯微鏡附帶的相機進行拍攝，在連接相機的電腦上記錄下拍攝的圖片。

1.3統計分析

實驗進行了兩次重復實驗，每個重復實驗至少進行三個平行實驗。數據統計使用DPS中單因素實驗統計分析以及Tukey法多重比較，顯著差異用p＜0.05表示。

2　結果與討論

2.1不同環境因素對乳狀液穩定性的影響

2.1.1不同pH對乳狀液穩定性的影響不同乳化劑制備的乳狀液在不同pH時的穩定性以分層穩定性表示，結果如圖1所示。從圖1中可以看到，通過高速乳化分散機的剪切作用制備的乳狀液由于乳化脂肪顆粒一般較大，在外力作用下分層速率較高，因而乳狀液穩定性不高，經過24h后乳脂層高度基本上都高于10%。同一乳化劑制備的在不同pH時分層穩定性沒有顯著差異（p＞0.05）。在中性pH條件下，馬鈴薯蛋白水解物的加入起到了輔助乳化的作用，提高了Tween20乳狀液的穩定性，降低了乳狀液的分層比例。這是由于蛋白水解物的加入會增加乳狀液表面的電荷分布［6］，從而可能通過顆粒間靜電排斥作用降低乳化顆粒間的聚集作用。

圖1　不同乳化劑制備乳狀液在不同pH時的穩定性Fig.1　Effect of pH on the creaming stability of emulsions prepared using different emulsifiers at the sodium chloride concentration of 50mmol/L

2.1.2不同氯化鈉濃度對乳狀液穩定性的影響不同乳化劑制備的乳狀液在不同氯化鈉濃度時的穩定性以分層穩定性表示，結果如圖2所示。和pH的結果相類似，高速乳化分散機制備得到的同一乳化劑的乳狀液在鹽濃度為50、200mmol/L兩個鹽濃度下的分層穩定性沒有顯著差異（p＞0.05）。在實驗的鹽濃度條件下，Tween 20制備的乳狀液的分層比例最高（p＜0.05），穩定性最低。這可能和Tween 20是非離子型乳化劑有關。由于是非離子性乳化劑，其吸附在乳狀液顆粒表面時形成的電位較低［7-9］，而氯化鈉的加入提高了乳狀液的離子強度，會進一步壓縮乳狀液顆粒的雙電層，使顆粒間的相互作用減弱而更易于聚集。

圖2　不同乳化劑制備乳狀液在不同氯化鈉濃度時的穩定性Fig.2　Effect of sodium chloride concentration on the creaming stability of emulsions prepared using different emulsifiers at pH7

2.1.3加熱對乳狀液穩定性的影響加熱對不同乳化劑制備乳狀液的穩定性以分層穩定性表示，結果如圖3所示。結果表明同一乳化劑的乳狀液在不同鹽濃度（50、200mmol/L）時的分層穩定性沒有顯著差異（p＞0.05）。與Tween20為乳化劑的乳狀液相比，馬鈴薯蛋白水解物的加入起到的輔助乳化作用不僅可以提高乳狀液常溫時的穩定性（p＜0.05），還可以提高乳狀液的熱穩定性（p＜0.05）。在NaCl濃度50、200mmol/L時，馬鈴薯蛋白水解物的加入乳狀液在經過熱處理后穩定性分別提高了50%和60%。但是添加0.5h和6h馬鈴薯蛋白水解物的乳狀液的穩定性間沒有顯著差異（p＞0.05），這表明蛋白水解物分子量對乳狀液穩定性沒有影響。熱處理可以引起乳清分離蛋白的變性，使其結構展開，減少乳化顆粒的聚集，因而經過熱處理的乳清蛋白穩定的乳狀液較未加熱時穩定性有一定程度的提高。

圖3　不同乳化劑制備乳狀液在不同氯化鈉濃度條件下經過熱處理后的穩定性Fig.3　Effect of heating（90°C，30min）on the creaming stability of emulsions prepared using different emulsifiers at pH7 with the sodium chloride concentration of 50 and 200mmol/L

2.2不同環境因素對乳化乳清蛋白凝膠性質的影響

2.2.1不同pH和鹽濃度對乳狀液填充乳清蛋白凝膠持水性的影響持水性是凝膠重要的性質之一。它和食品多汁性之間有一定的關聯性。不同pH和不同鹽濃度對乳化顆粒填充乳清蛋白凝膠持水性的影響如圖4所示。大部分乳化顆粒填充乳清蛋白凝膠在中性pH條件下的持水性相對酸性pH條件時有小幅度的提高。在酸性條件下，乳化顆粒填充乳清蛋白凝膠的持水性較無填充的乳清蛋白凝膠的持水性沒有顯著性的提高（p＞0.05）。而在中性pH條件下，有乳狀液填充的乳清蛋白凝膠的持水性比對照樣品以水為溶劑制備的無填充的乳清蛋白凝膠的持水性高（p＜0.05）。盡管鹽濃度對同一乳狀液填充凝膠的持水性沒有顯著性影響，但是不同鹽濃度條件下乳清蛋白凝膠持水性提高的程度則不同。在pH7條件下，當鹽濃度為50mmol/L時，乳清分離蛋白和Tween 20制備的乳狀液填充的乳清蛋白凝膠的持水性相對于對照的無填充乳清蛋白凝膠分別提了43.6%和45.8%；當鹽濃度提高到200mmol/L時，乳清分離蛋白和Tween 20制備的乳狀液填充的乳清蛋白凝膠的持水性相對于對照的無填充乳清蛋白凝膠分別提高了28.4%和29.7%。增加鹽濃度并不會增加乳狀液填充凝膠的持水性，這與陳沖等［10］的結果相一致。研究結果表明，高速乳化分散機制備的大分子蛋白為乳化劑的乳狀液在凝膠網絡中的活性填充以及小分子Tween 20為乳化劑的乳狀液在凝膠網絡中的非活性填充并不會降低凝膠的持水性。可見，凝膠網絡空間中乳化顆粒的力學支撐作用和乳狀液乳化顆粒界面與凝膠網絡中蛋白的鍵合作用對凝膠的持水性同樣重要。同時，馬鈴薯水解蛋白的加入盡管降低了乳狀液的穩定性，但是對凝膠持水性的影響較小，只是引起了凝膠持水性較低程度的降低。可見乳狀液的穩定性和凝膠持水性之間有一定聯系。

圖4　不同乳化劑乳狀液制備得到的乳狀液填充乳清蛋白凝膠在不同pH和不同氯化鈉濃度時的持水性Fig.4　Effect of pH on the water holding capacity of emulsionfilled whey protein gel prepared using different emulsifiers stabilized emulsions at the sodium chloride concentration of 50 or 200mmol/L

2.2.2不同pH和鹽濃度對乳化乳清蛋白凝膠強度的影響和持水性一樣，凝膠強度也是凝膠重要的性質之一。它和食品在口腔中的感官性質如咀嚼性等有一定的關聯性。不同pH和不同鹽濃度對乳狀液填充乳清蛋白凝膠持水性的影響如圖5所示。和持水性的結果不同，pH和鹽濃度對凝膠強度有較大的影響。

在鹽濃度為50mmol/L時，中性pH條件下不管是大分子為乳化劑、還是小分子為乳化劑制備的乳清蛋白凝膠強度都要高于酸性條件下同一乳化劑制備的乳清蛋白凝膠強度，以乳清蛋白、Tween 20、Tween 20+0.5h-PPH以及Tween 20+6h-PPH為乳化劑得到的乳狀液填充乳清蛋白凝膠的凝膠強度分別提高了1.73、1.71、30、9.37倍。大部分乳狀液填充乳清蛋白凝膠的凝膠強度較無填充的乳清蛋白凝膠的凝膠強度有顯著提高（p＜0.05）。這可能是由于乳化顆粒在凝膠網絡中起到了一定的填充效應如物理支撐作用。當鹽濃度為50mmol/L時，中性pH條件下乳清分離蛋白和Tween 20、Tween 20+0.5h-PPH以及Tween 20+6h-PPH為乳化劑制備的乳狀液填充乳清蛋白凝膠的凝膠強度相對于對照的無填充乳清蛋白凝膠分別提高了73.8、70.6、55.2、44.3倍。

在酸性條件（pH3）下，以乳清蛋白和Tween20為乳化劑得到的乳狀液填充乳清蛋白凝膠的凝膠強度在鹽濃度為50、200mmol/L沒有顯著差異（p＞0.05）。這可能是由于酸性條件下，乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白會發生聚集［11］，不能形成較強的凝膠網絡結構，不同鹽濃度下乳化顆粒對凝膠網絡的填充作用差異較小。盡管Tween 20+0.5h-PPH以及Tween 20+6h-PPH為乳化劑制備的乳狀液填充乳清蛋白凝膠的凝膠強度在鹽濃度為50、200mmol/L時有顯著差異（p＜0.05），但是其凝膠強度很弱，并且和無填充凝膠相比強度沒有提高。這可能是由于Tween 20+0.5h-PPH以及Tween 20+6h-PPH為乳化劑制備的乳狀液界面形成的負電位在乳清蛋白分子間形成了較弱的橋連作用，反而破壞了乳清蛋白分子間的交聯，不利于凝膠網絡的形成。

圖5　不同乳狀液填充乳清蛋白凝膠在不同pH和氯化鈉濃度時的凝膠強度Fig.5　Effect of pH on the gel strength of emulsion-filled whey proteingelpreparedusingdifferentemulsifiersstabilizedemulsions at the sodium chloride concentration of 50 or 200mmol/L

在中性pH（pH7）條件下，同一乳化劑得到的乳狀液填充乳清蛋白凝膠在鹽濃度為50mmol/L時的凝膠強度較200mmol/L時分別提高了1.79、1.91、2.97、21.3倍（p＜0.05）。這可能是由于價低濃度的NaCl中和了一部分蛋白的靜電荷，降低了蛋白分子間的靜電排斥作用，增強了蛋白分子間的疏水作用，使乳清蛋白在熱凝膠過程中蛋白分子間靜電斥力和疏水作用形成了一種合理的平衡狀態。這有利于蛋白質凝膠空間網絡結構的形成，使乳化顆粒可以在空間結構中起到有效支撐的作用，增強凝膠強度。但是鹽濃度較高時乳清蛋白產生較強靜電屏蔽作用，導致蛋白分子間疏水作用過大，破壞了靜電斥力和疏水作用的平衡，部分蛋白分子在疏水作用下易形成分子聚集，不利于空間網絡的形成，不能充分發揮乳化顆粒的活性填充效應，導致凝膠強度下降。

圖6　不同乳化劑制備乳狀液的顯微圖片（200×）Fig.6　Microscopy pictures of emulsions prepared using different emulsifiers at pH7 at the sodium chloride concentration of 50mmol/L（200×）

在Mcclements等［12］的研究中，以Tween 20為乳化劑的乳狀液填充乳清蛋白凝膠的強度和對照樣品相比并沒有顯著提高，這和我們的結果有很大不同。這可能是由于乳狀液制備方式的不同導致的。盡管乳狀液界面上Tween 20與凝膠網絡之間化學作用較弱，但本研究制備得到的乳狀液顆粒可能對凝膠網絡的力學支撐效果更好。

2.2.3乳狀液的微觀結構由于在pH7和氯化鈉濃度50mmol/L條件下各乳化劑制備得到的乳狀液填充凝膠的持水性和凝膠強度較好，因此選擇這一條件下的乳狀液進行微觀結構的觀察，結果見圖6。從圖6可以看出，Tween 20制備得到的乳狀液中大尺寸的乳化脂肪顆粒比例相對較高，因此得到的乳狀液穩定性相對較低。水解馬鈴薯蛋白的加入顯著降低了乳狀液中大尺寸乳化顆粒的數量。根據斯托克方程，含水解馬鈴薯蛋白的乳狀液中乳化顆粒上浮速率將下降，穩定性提高，這和分層穩定性的結果相吻合。盡管研究表明乳狀液中乳化顆粒尺寸在一定范圍內的減小可以增加凝膠的強度［3，12］，但是在本研究中馬鈴薯水解蛋白的加入降低了乳狀液填充凝膠的凝膠強度。這可能是由于界面上吸附的馬鈴薯蛋白水解物與乳清蛋白的靜電及疏水作用不利于凝膠網絡的形成并妨礙了乳狀液顆粒在凝膠網絡里的分布［4，12-13］。而乳清蛋白得到乳狀液中顆粒大小較小，并且其界面上吸附的乳清蛋白還可以和凝膠網絡中的蛋白分子有物理或是化學鍵合作用，其凝膠強度則較高。可見，對于凝膠網絡的非活性填充，界面組成可能比合適的填充劑尺寸（乳化顆粒大小）更重要。而對于活性填充，合適的填充劑尺寸以及界面組成與凝膠網絡的鍵合作用同樣重要。

3　結論

3.1馬鈴薯蛋白水解物可提高乳狀液的穩定性。鹽的添加及熱處理可使乳狀液穩定性有不同程度的降低。

3.2以乳狀液為溶劑制備的凝膠持水性不會低于以水為溶劑制備的凝膠的持水性。加入一定量的氯化鈉有助于乳狀液凝膠持水性的增加，pH=7時的乳狀液填充凝膠的持水率較高。

3.3以乳狀液為溶劑制備的凝膠，其強度高于以水為溶劑制備的凝膠。加入一定量的氯化鈉也可提高凝膠強度。在中性（pH=7）、低離子強度（50mmol/L）條件下，乳狀液填充凝膠的凝膠強度較高。

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Effect of interface composition on gel strength and water holding capacity of emulsion-filled whey protein gels

CHENG Yu，CHENG Ke，LI Huan，SHI Hai-yue，WANG Dan
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

Effect of different environmental conditions including different pH（3，7），different concentration of sodium chloride（50，200mmol/L）and heat treatment（90℃，30min）on stability of emulsions prepared using different emulsifiers（WPI，Tween20，Tween+potato protein hydrolysate）by gravitational separation methods were investigated.Emulsions prepared using different emulsifier including WPI，Tween20 and Tween+potato protein hydrolysate by high speed homogenization method were used as solvent to prepare protein gels.Heat set emulsion-filled whey protein gels were prepared at the protein concentration of 12%（w/v）at different pH（3，7）and concentration of NaCl（50 and 200mmol/L）by heating at 90℃for 30min.Results showed that gel strength and water holding capacity of gel prepared using emulsion as solvent were higher than the gel prepared with water.Adding sodium chloride could effectively improve the strength and water holding capacity of the gel.It was shown that environmental conditions including pH and salt had effect on gel strength of emulsion-filled whey protein gels.Moreover，emulsion properties had effect on water holding capacity and gel strength of emulsion-filled whey protein gels.

whey protein gel；emulsion；water holding capacity；gel strength

TS201.1

A

1002-0306（2015）10-0130-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.018

2014－07－30

程宇（1981－），男，博士，講師，研究方向：食品蛋白質功能。

國家自然科學基金（31301422）；江蘇省自然科學基金（BK20130494）；高等學校博士學科點專項科研基金（20123227120018）；江蘇大學高級專業人才科研啟動基金（11JDG051）；中國博士后基金（2012M521017）。