地塞米松誘導肺腺癌對紫杉醇耐藥與Survivin基因表達

康馬飛* 李林鳳

（桂林醫學院，廣西 桂林 541001）

地塞米松誘導肺腺癌對紫杉醇耐藥與Survivin基因表達

康馬飛* 李林鳳

（桂林醫學院，廣西 桂林 541001）

目的 觀察不同濃度地塞米松（DEX）預處理后，再予紫杉醇（PTX）干預后人肺腺癌細胞的耐藥情況及Survivin基因mRNA及蛋白表達的變化。方法 用四唑鹽（MTT） 試驗測定不同濃度PTX作用于肺腺癌A549細胞后的細胞存活率, 篩選出PTX的半數抑制濃度（IC50）。用不同濃度DEX預處理A549細胞后，再予不同濃度PTX作用于A549細胞，用MTT試驗測定細胞存活率，用RT-PCR和Western Blot法檢測細胞中Survivin基因mRNA和蛋白的表達水平。結果 不同濃度的DEX預處理A549細胞后能誘導其對PTX產生耐藥，細胞耐藥率隨DEX濃度的增加而增高。Survivin基因mRNA和蛋白的表達水平隨DEX濃度的增加而增高。結論 地塞米松能誘導肺腺癌細胞對紫杉醇產生耐藥，其機制可能與地塞米松誘導肺腺癌細胞抗凋亡基因Survivin基因表達增加有關。

地塞米松；肺腫瘤；Survivin；抗凋亡基因；癌；細胞系；抗藥性

化療是治療惡性實體瘤的主要手段之一，糖皮質激素因能促淋巴細胞凋亡，廣泛用于淋巴、血液系統腫瘤及其他腫瘤的聯合治療（如止吐，某些化療藥物使用前的預處理）。然而，新的資料表明，糖皮質激素能誘導大多數惡性實體瘤產生化療耐藥，但機制尚未完全明確。本研究通過不同濃度地塞米松預處理肺腺癌細胞后再給予紫杉醇干預，觀察細胞耐藥發生情況及細胞耐藥發生與抗凋亡基因survivin基因表達的變化關系，以探討地塞米松誘導實體瘤化療耐藥的機制。

1　材料與方法

1.1材料：①細胞株：采用人肺腺癌A549細胞株（中科院細胞庫提供）。②藥物：地塞米松，紫杉醇。③試劑：RPMI-1640培養基、胰酶（美國GIBCO公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），四甲基偶氮唑鹽（美國Sigma公司），瓊脂糖（上海普飛生物技術公司），TBE、EB（上海碧云天生物技術公司）。④survivin及GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成。RNAiso PLUS（total RNA提取試劑）、PrimeScript RT reagent Kit（反轉錄試劑盒）、SYBR Premix Ex TaqⅡ（PCR擴增試劑盒）由天根生化科技有限公司提供。總蛋白提取試劑盒由上海貝博生物科技有限公司提供。BCA蛋白定量試劑盒由北京艾德萊生物科技有限公司提供。ECL超敏發光試劑盒由北京博奧森生物科技有限公司提供。Western Blot兔抗鼠survivin單克隆抗體（一抗）由美國Epitomics公司提供。β-actin鼠單抗（一抗）由碧云天生物科技有限公司提供。

1.2方法

1.2.1細胞培養：A549細胞在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下，于含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L的RPMI-1640培養液中生長，2～3 d傳代1次。

1.2.2MTT 法測定紫杉醇對A549細胞的半數抑制濃度（IC50）：收集呈指數生長的A549細胞，用0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液。取1×104/mL細胞懸液接種于96孔培養板內，每孔200 μL，設置空白孔（完全培養液），對照孔（細胞、完全培養液），實驗孔（細胞、完全培養液），對照組及實驗組各濃度分別設3個復孔，然后置于37 ℃、5% CO2孵箱內培養24 h后，于實驗孔中加入不同濃度的紫杉醇干預，紫杉醇的終濃度設置為15、25、35 μmol/L，于對照孔加入等體積的PBS液，置于37 ℃、5% CO2孵箱內繼續培養24 h。然后每孔加入MTT溶液20 μL（5 g/L），繼續孵育4 h，終止培養。吸棄上清液，加入DMSO，選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度（A）值。細胞存活率（Surv%）=（實驗孔A值-空白孔A值）/（對照組A值-空白孔A值）×100%。抑制率=1-細胞存活率。IC50用SPSS17.0軟件以Probit回歸法計算得出。

表1　各組細胞存活率比較

圖1　各組細胞Survivin mRNA表達水平比較

圖2　RT-PCR法檢測細胞中Survivin mRNA表達

圖3　Survivin蛋白表達水平比較

1.2.3MTT法測定地塞米松誘導A549細胞對紫杉醇的反應：同1.2.2中設置空白孔（完全培養液），對照孔（細胞、完全培養液），實驗孔（細胞、地塞米松、完全培養液），其中地塞米松濃度分別設置為0.1、1、10 μmol/L，對照組及實驗組各濃度分別設3個復孔，培養24 h后，于對照組及實驗孔加入紫杉醇濃度分別為0.1 mol/L、1倍IC50，繼續培養24 h。同1.2.2中酶聯免疫法測定各孔吸光度及計算細胞存活率。

1.2.4RT-PCR法檢測細胞中Survivin mRNA水平：收集呈指數生長的A549細胞，取1×104/mL細胞懸液接種于90 mm培養皿內，設置對照組（細胞、完全培養液），實驗組（細胞、地塞米松、完全培養液），同1.2.3中設置地塞米松濃度培養24 h后，分別于對照孔及實驗孔中加入紫杉醇，濃度分別為0.1 mol/L、1倍IC50，繼續培養24 h。以PBS清洗并調整細胞為1.5 mL Eppendorf管1×107個，離心后盡棄PBS，按照試劑盒說明書方法提取總RNA，純度鑒定合格后保存于-70 ℃備用。各樣品取1 μg RNA，進行cDNA合成及PCR擴增。引物序列：survivin（118bp）上游5-GGACCACCGCATCTCTACAT-3，下游5-CAAGTCTGGCTCGTTCTCAGT-3，GAPDH（106 bp）上游5-CCGCATCTTCTTTTGCGTCG-3，下游5-AGTTAAAAGCAGCCCTG GTGA-3。熱啟動法進行PCR，反應條件:94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃梯度退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃延伸5 min，共30個循環，取10 μL擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色后于凝膠圖像分析儀進行掃描分析。對基因表達量與GAPDH表達量的比值進行比較。實驗重復3次。

1.2.5蛋白免疫印跡法（Western-Blot）檢測survivin蛋白表達水平：按試劑盒操作步驟提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。取40 μg蛋白加入上樣緩沖液變性待用。制備SDS-PAGE膠，濃縮膠90V電壓電泳40 min，分離膠120 V電壓電泳1 h，轉膜（濕轉法）前準備好6張薄濾紙和1張PVDF膜（PVDF膜用前置于甲醇中激活30 s），PVDF膜的面積≥濾紙面積≥凝膠面積，PVDF膜、濾紙和凝膠置于1×轉移緩沖液中浸泡20 min。按（-）海綿/三層薄濾紙/凝膠/PVDF膜/三層薄濾紙/海綿（+）的順序夾好夾子，盡量趕盡每層之間的氣泡。夾子按轉移槽的正負極正確放置，調節電壓至100 V，轉膜1 h（因為電轉移時會產熱，所以要在轉移槽的周圍放冰用于降溫）。轉膜結束后取出PVDF膜，將膜用TBS輕輕漂洗后，移至含有封閉液的平皿中，37 ℃ 封閉1 h。將封閉后的PVDF膜用TBST洗滌3次，每次5 min。survivin一抗按1∶500稀釋，將抗體滴加到PVDF膜上，封膜，37 ℃孵育2 h或4 ℃孵育過夜。一抗作用后，將膜取出，用TBST洗滌3次，每次5 min，讓其與堿性磷酸酶標記的二抗反應，反應條件為37 ℃ 1～2 h。二抗山羊抗兔IgG 1∶1000稀釋孵育完成后，將膜取出，用TBST洗滌3次，每次5 min，顯色液顯色5～10 min，待目的條帶清晰后終止顯色反應，顯色后的PVDF膜在半干時拍照。

1.3統計學處理：采用SPSS17.0進行統計分析，實驗數據以（）表示，多組均數間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結 果

2.1紫杉醇對A549細胞的半數抑制率（IC50）：不同濃度（0.1、1、10 μmol/L）處理A549細胞后，A值分別為（0.803±0.014）、（0.767 ±0.017）、（0.748±0.001），對照組A值為（0.846±0.030）。不同濃度紫杉醇作用對應的細胞的存活率分別為13.3%、36.9%和58.1%；由Probit法得出紫杉醇對A549細胞的IC50為28.66 μmol/L。

2.2不同濃度地塞米松誘導A549細胞對紫杉醇的反應：不同濃度地塞米松預處理的A549細胞再予紫杉醇干預后，A549細胞對紫杉醇顯示出典型的耐藥，且與地塞米松的濃度呈劑量依賴關系。細胞的存活率及比較結果見表1。

2.3各組A549細胞的Survivin mRNA及蛋白表達水平：不同濃度地塞米松預處理的A549細胞再予紫杉醇干預后，A549細胞Survivin mRNA及蛋白表達明顯增加，且與地塞米松的濃度呈劑量依賴關系。見表2、表3、圖1～圖3。

3　討 論

在過去的研究中，已證實糖皮質激素可誘導多種實體瘤對化療藥物耐藥[1-2]。一項研究從切除的患者標本中分離出肺癌細胞，分為加地塞米松和不加地塞米松兩組。結果顯示，全部10份含地塞米松的標本對順鉑（DDP）、吉西他濱（GEM）耐藥[3]。一項研究從21例前列腺癌患者中分離的新鮮細胞，經地塞米松預處理后對PTX、GEM、DDP、5-氟尿嘧啶（5-FU）和γ射線耐藥[4]。有研究者檢測了8個細胞系，18個手術切除標本和裸鼠移植物的凋亡誘導率、存活率、腫瘤生長和蛋白表達情況。在有地塞米松存在的情況下，強烈抑制5-FU、DDP、GEM或γ射線引起的腫瘤細胞凋亡，結腸癌和肝癌細胞的生存能力增強，生長加快。該研究認為糖皮質激素誘導結腸癌和肝癌細胞對化療耐藥不是偶然出現，而是很普通的現象，說明使用糖皮質激素對癌癥患者是有害的[5]。本研究也進一步證實，A549細胞在地塞米松預處理后對PTX耐藥，且與DEX的濃度呈劑量依賴關系，耐藥隨DEX濃度增加而增強。

表2　各組細胞Survivin mRNA表達水平比較

表3　各組細胞Survivin 蛋白表達水平比較

Survivin為人類凋亡抑制蛋白家族的新成員，在正常分化的成人組織中幾乎不表達，但在各種腫瘤組織中常呈高度表達。軟骨肉瘤中Survivin高表達且在體外表現對化療耐藥[6]。有研究顯示Survivin異常高表達使卵巢腫瘤細胞對多種化療藥物的耐受性增加，并介導卵巢癌多藥耐藥的形成[7]。NSCLC患者Survivin蛋白表達陽性預示對紫杉醇治療相對不敏感[8]。NSCLC組織中Survivin表達陽性提示順鉑耐藥[9]。survivin高表達的進展期胃癌患者對多西紫杉醇化療耐藥[10]。上述的研究都表明，survivin高表達的實體瘤對化療耐藥。本研究結果提示，肺腺癌細胞經地塞米松預處理后，survivin mRNA和蛋白表達均明顯增加，說明地塞米松誘導survivin基因表達增強。本研究結果顯示，survivin mRNA和蛋白表達均隨地塞米松的濃度增高而增加，而且在紫杉醇存在的情況下比無紫杉醇存在的情況下表達更高。提示糖皮質激素使用量越大，可能越容易導致化療耐藥，同時也提示，在化療期間同時使用糖皮質激素可能更容易導致化療耐藥。該研究也從另一方面提示，針對survivin的治療可能是逆轉化療耐藥的一個途徑。目前有研究使用基因沉默方法抑制survivin基因表達，可抑制化療耐藥[11-16]。但臨床中如何抑制survivin基因表達尚有待于以后的研究。

總之，本研究結果表明，地塞米松可誘導肺癌對化療耐藥，抗凋亡基因survivin表達增強是地塞米松誘導肺癌對化療耐藥的機制之一。

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Dexamethasone Induced Resistance to Paclitaxe in Adenocarcinoma of Lung and Expression of Survivin Gene

KANG Ma-fei, LI Lin-feng
(Guilin Medical University, Guilin 541001,China)

Objective To observe the changes of the drug resistance and the expression of mRNA and protein of survivin in human lung adenocarcinomal cells after dexamethasone(DEX) pretreatment in different concentrations and treatment with paclitaxel(PTX). Methods The cells viability rate of lung adenocarcinoma A549 cells was determined by MTT assay (mononuclear cell direct cytoxicity assay) after treatment of different concentrations of PTX, and to estimate the concentration of IC50of PTX. The cells viability rate of A549 cells which pretreated with different concentrations of DEX was determined by MTT assay after treatment of different concentrations of PTX, and the expression level of mRNA and protein of survivin in all of the A549 cells were determined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western Blot. Results After being pretreated with DEX in different concentrations, A549 cells were induced resistance to PTX,and the rate of resistance increased gradually with the increasing concentrations of DEX and the expression level of survivin mRNA and protein increased gradually with the increasing concentrations of DEX also. Conclusions Dexamethasone can induce resistance to paclitaxel in lung adenocarcinoma cells, and survivin , a gene of anti-apoptosis, may be involved in the path-ways of chemotherapy resistance of lung adenocarcinoma through inhibition of cellular apoptosis.

Dexamethasone; Lung neoplasms; Survivin; Anti apoptotic gene; Carcinoma; Cell line; Drug resistance

R734.2

B

1671-8194（2015）33-0001-03

廣西衛生廳計劃課題（項目編號：Z2013479）

E-mail:kmfgl@163.com