甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因外顯子多態性分析

李積友梁春花劉霞孫雪婧杜曉華1，

（1.甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，蘭州 730070；2.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；3.甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；4.甘肅省畜牧業產業管理局，蘭州 730030）

甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因外顯子多態性分析

李積友1，4梁春花2劉霞1，3孫雪婧2杜曉華1，2

（1.甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，蘭州 730070；2.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；3.甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；4.甘肅省畜牧業產業管理局，蘭州 730030）

采用PCR-SSCP方法檢測50頭甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因3個外顯子的遺傳多態性，并對群體內各等位基因進行測序，旨為探討西門塔爾牛MSTN基因與肉質性狀關聯等方面的研究提供理論依據。結果顯示，甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因3個外顯子中，外顯子2受B、C等位基因控制，形成BB、CC和BC 3種基因型，基因型頻率分別為0.22（11/50）、0.64（32/50）、0.14（7/50）；外顯子1和外顯子3分別受A等位基因與D等位基因控制，形成AA和DD基因型，基因型頻率均為1（50/50）。序列分析表明，甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因3個外顯子中，外顯子2在第41 bp處發生了C→T的突變，但并沒有導致氨基酸發生改變，屬于同義突變；外顯子1和3均無突變。統計結果表明，甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因3個外顯子中，外顯子2為中度多態，其余均無變化。

MSTN基因；外顯子；遺傳多態性；西門塔爾牛

肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）屬于轉化生長因子超家族的一員，對動物肌肉的分化和生長具有重要的負調控功能［1］。研究發現，該基因不同位點的單一變異均可能導致其活性的降低或喪失，從而表現出“雙肌”性狀［2］，在肉用家畜的品種選育方面有重要作用。截至目前，已有學者對豬、綿羊、普通牛和牦牛等家畜MSTN基因多態性進行了相關的研究報道［3-8］。本研究采用PCR-SSCP方法對甘肅甘州地區西門塔爾牛MSTN基因3個外顯子進行多態性分析，探討西門塔爾牛甘州類群MSTN基因的分子遺傳特征，旨為豐富西門塔爾牛MSTN基因的遺傳數據以及甘肅西門塔爾牛品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗隨機選取甘肅省張掖市甘州區的50頭西門塔爾牛，每頭牛頸靜脈采血10 mL，ACD（酸性檸檬酸葡萄糖）抗凝，用常規苯酚-氯仿法從血樣中提取甘州西門塔爾基因組DNA，-20℃凍存。

蛋白酶K、Tris平衡酚購自大連寶生物工程有限公司；丙烯酰胺、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）購自Amersco公司；過硫酸銨購自煙臺市雙雙化工有限公司；去離子甲酰胺、TEMED購自Sigma公司；甲叉購自上海生工生物工程股份有限公司；2×Power Taq PCR Master Mix購自北京百泰克生物技術公司；DNA marker購自上海捷瑞生物工程有限公司；其他常規試劑均為進口或國產分析純級產品。

梯度PCR儀：美國ABI公司生產；PROTEANⅡ xi Cell雙垂直電泳槽、PowerPac Universal電泳儀：美國Bio-Rad公司生產；F32加熱/制冷循環儀：德國Julabo公司生產。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與PCR擴增 參考GenBank中的牛（AC_000159）MSTN基因序列，用Primer 3.0軟件設計3個外顯子引物，其引物序列及預擴增片段的長度詳見表1，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 西門塔爾牛甘州類群MSTN基因3個外顯子的引物序列及預擴增片段長度

PCR反應體系為20 μL：其中ddH2O 7.4 μL，引物F和R各0.4 μL，預混酶11 μL，模板DNA0.8 μL，反應條件：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，退火30 s，外顯子1、2、3的退火溫度分別是57℃、56℃、58℃，72℃延伸30 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 SSCP檢測 取2 μL的PCR產物加入8 μL的變性上樣緩沖液（980 mL/L去離子甲酰胺，0.25 g/L溴酚藍，0.25 g/L二甲苯青，pH8.0、0.01 mol/L EDTA），105℃變性10 min，立即冰浴10 min。外顯子1、2、3均用交聯度39∶1、濃度14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，150 V電泳24 h，溫度分別4℃、10℃、10℃，銀染法顯色后拍照。

1.2.3 序列分析 PCR產物送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。利用DNAStar軟件包中的EditSeq和MegAlign程序進行DNA序列的剪切校對、比對和翻譯，堿基組成一致的序列判定為同種等位基因。

1.2.4 數據統計分析 基因型頻率、基因頻率統計和χ2檢驗，基因雜合度（Heterozygosity，He）及有效等位基因數（Effective number of alleles，Ne）檢測利用POPGENE（版本1.32）軟件完成，多態信息含量（Polymorphism information content，PIC）利用PIC_Calc（版本0.6）軟件進行分析。

2 結果

2.1 PCR擴增

甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因3個外顯子用瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），擴增產物與預期擴增片段的長度相符，且條帶清晰明亮無雜帶，可直接用于SSCP分析。

2.2 SSCP檢測

SSCP分析結果顯示，所檢測的50頭西門塔爾牛甘州類群中外顯子1僅發現了AA一種基因型，外顯子3只發現了CC一種基因型，二者均無多態性（圖2、圖4）；外顯子2共發現了BB、CC、BC 3種基因型，受B和C等位基因控制（圖3）。

圖1 西門塔爾牛甘州類群MSTN基因3個外顯子的PCR擴增

圖2 西門塔爾牛甘州類群MSTN基因外顯子1的PCRSSCP檢測

圖3 西門塔爾牛甘州類群MSTN基因外顯子2的PCRSSCP檢測

圖4 西門塔爾牛甘州類群MSTN基因外顯子3 PCR-SSCP檢測

2.3 序列分析

對具有多態性的PCR產物進行克隆測序，得到甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因3個外顯子的核苷酸序列。將測序結果與GenBank中普通牛（AC_000159）的序列進行比較分析，外顯子1只發現了AA一種基因型，且AA型與普通牛的相應序列一致；外顯子3只發現了DD一種基因型，且DD型與普通牛的相應序列一致，外顯子1和3均無多態性；外顯子2發現了BB、CC、BC三種基因型，受B和C等位基因控制，且BB等位基因與普通牛的相應序列一致。外顯子2的C等位基因與B等位基因相比，在41 bp處發生C→T突變（圖5），但未引起氨基酸序列的變化，為同義突變。

2.4 遺傳多態性分析

對50頭甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因3個外顯子等位基因的基因型頻率和基因頻率進行了統計，結果顯示，外顯子1僅存在AA一種基因型，外顯子3只存在CC一種基因型，外顯子1和3的基因型頻率均為1（50/50）；外顯子2具有BB、CC、BC三種基因型，其基因型頻率分別為0.22（11/50）、0.64（32/50）、0.14（7/50），其中CC基因型為優勢基因型。B、C兩個等位基因的基因頻率頻率分別為0.29、0.71，C等位基因是甘肅西門塔爾牛甘州類群的優勢等位基因。χ2檢測結果顯示，MSTN基因3個外顯子的3種基因型在甘肅西門塔爾牛甘州類群中處于Hardy-Weinberg平衡狀態（P＞0.05）。甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因外顯子2突變位點的雜合度（He）、有效等位基因數（Ne）及多態信息含量（PIC）的值分別為0.1400、1.7001和0.32706，表現為中度多態。

3 討論

MSTN基因對骨骼肌的生長具有負調節作用，該基因雖然在進化過程中很保守，但也存在一定的多態性。目前研究結果證實，MSTN基因突變可以導致牛具有雙肌性狀，表型特征是臀部、大腿、上臂、胸及起支撐作用的中前端肌肉群異常發達，皮下脂肪少，而有更多的脂肪沉積于肌纖維之間，皮膚薄［9］。迄今為止，已經在14種牛中發現了雙肌現象。在肉牛中，MSTN基因的3個外顯子上已發現9個影響氨基酸序列的變異，其中6個可導致“雙肌”。Lee等［10］在皮埃蒙特牛MSTN基因中發現某些單核苷酸替換導致了MSTN蛋白質功能的喪失。Kambadur等［11］和Miranda等［12］在研究比利時藍牛“雙肌”性狀時發現，其MSTN基因第3外顯子處一個11 bp的缺失是造成比利時藍牛產生“雙肌”性狀的原因。Grobet等［13］檢測了10個歐洲牛品種的32頭雙肌牛，結果發現了7個DNA多態性，其中5個推測造成了蛋白質功能的改變，1個為保守氨基酸替換，另一個為沉默DNA突變；在內含子中檢出了4個DNA多態型。冀德君等［14］研究了中國普通牛、瘤牛、大額牛和牦牛4個牛屬該基因外顯子區核苷酸序列的變異，結果顯示，4個中國牛種的MSTN基因發現7個核苷酸多態位點。

圖5 BB、BC和CC基因型位于41 bp處突變的測序峰圖

本研究利用PCR-SSCP方法分析了甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因3個外顯子的多態性，結果顯示，外顯子1僅檢測出A等位基因，形成一種AA基因型；外顯子2在其第41 bp處存在單堿基的突變，有B、C兩個等位基因，其中C等位基因為優勢等位基因，形成BB、BC和CC三種基因型；外顯子3只檢測到D等位基因，形成一種DD基因型；在對50頭甘肅西門塔爾牛甘州類群群體基因型的檢測中，外顯子1僅發現1例AA型突變純合體，外顯子3也只檢測到1例DD型突變純合體，外顯子1和3均未檢測到雜合基因型，這一結果與呂文發等［15］報道的中國西門塔爾群體中外顯子1發現了AC、CC兩種基因型的結果不一致。原因可能是本實驗的研究對象為50頭甘州地區的西門塔爾牛類群，其樣本數量不夠多、樣本來源比較集中、地理條件差異、氣候溫度等有關，也可能是由于引進西門塔爾牛的代數不長或是隨著西門塔爾牛與甘州當地的黃牛雜交代數的增加，經過自然淘汰或人工選擇其基因型趨于穩定狀態，外顯子1的AA型和外顯子3的DD型被保留了下來，具體原因有待進一步的實驗證實。外顯子2只發現7個BC基因型，其基因型頻率遠低于BB和CC型，同時純合體CC基因型頻率也遠高于BB和BC型，結果表明C等位基因在長期的人工選育過程中受到正向選擇，處于優勢地位。在甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因外顯子2中發現1處突變位點即第41 bp處C→T堿基的顛換，但并沒有導致西門塔爾牛甘州類群MSTN基因氨基酸的改變，其是否會對整個MSTN的蛋白功能產生一定的影響，有待進一步的實驗研究。

多態信息含量（PIC）和雜合度（He）都是群體內遺傳變異的測度，其值的高低反映了群體內個體的均質度，遺傳變異大，數值就高。Botstein等［17］提出了確定位點多態性的標準：PIC＞0.5為高度多態，PIC＜0.25為低度多態，0.25＜PIC＜0.5則為中度多態。本研究中，甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因外顯子2基因座的多態信息含量是0.327 0，呈現中度多態，外顯子1和3均無多態。通過對甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因3個外顯子的遺傳多態性分析發現，甘肅西門塔爾牛甘州類群處于Hardy-Weinberg平衡狀態。這可能是由于甘肅西門塔爾牛甘州類群選擇壓力不強，因此在人工選擇、遷徙和遺傳漂變等各種因素的作用下該基因座處于動態平衡中。說明甘肅西門塔爾牛甘州類群群體內遺傳比較穩定，這可能與甘肅西門塔爾牛甘州類群的本品種選育有關。

目前，對于MSTN的研究相當廣泛。MSTN突變的動物不僅骨骼肌群分布廣泛，且肉質性狀優良，MSTN基因已成為畜禽肉質性狀的最主要標記基因，因此在畜牧業上，可以篩選MSTN基因突變的個體，通過育種培育出產肉率高的優良畜禽品種。

4 結論

甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因外顯子1由A等位基因控制，外顯子3由D等位基因控制，外顯子1和3分別形成AA基因型和DD基因型；外顯子2由B、C兩個等位基因控制，存在BB、CC和BC三種基因型，基因型頻率分別為0.22，0.64，0.14。與其他牛相比，甘肅西門塔爾牛甘州類群MSTN基因僅外顯子2在41 bp處發生了C→T的突變，外顯子1和3均無多態，外顯子2基因座的PIC值為0.3270，呈中度多態。

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（責任編輯 李楠）

Polymorphism Analysis of MSTN Gene Exons of Ganzhou Simmental Cattle in Gansu Province

Li Jiyou1，4Liang Chunhua2Liu Xia1，3Sun Xuejing2Du Xiaohua1，2
（1. Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology，Lanzhou 730070；2. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；3. College of Life Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；4 Gansu Provincial Bureau of Animal Husbandry Industry Management，Lanzhou 730030）

PCR-SSCP（single-strand conformational polymorphism）was used to detect the genetic polymorphism in 3 exons of myostatin（MSTN）gene in 50 individuals of Ganzhou Simmental cattle in Gansu. The alleles in a population were verified by sequencing， which provided the theoretical evidences for investigating the correlation between MSTN gene of Simmental cattle and meat quality. The results showed that the polymorphism in the exon 2 was controlled by B and C alleles， which formed 3 genotypes of BB， CC and BC with the frequencies at 0. 22（11/50），0. 64（32/50）and 0. 14（7/50）respectively. The polymorphism in the exon 1 and exon 3 was controlled by A and D allele respectively， which formed AA and DD genotypes with frequencies at 1（50/50）. Sequence analysis indicated that there was one single nucleotide mutation of C to T at 41stnucleotide in the exon 2 of Ganzhou Simmental cattle；however this did not lead to the amino acid changed， so it was a synonymous mutation. There were no mutations in the exon 1 and exon 3. The statistical results showed that the exon 2 of MSTN gene in 50 individuals of Ganzhou Simmental cattle had a moderate level of polymorphism， and the exon 1 and exon 3 had no polymorphism.

MSTN gene；exon；genetic polymorphism；Simmental cattle

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.026

2014-10-29

甘肅省草食畜牧業發展行動（GNKJ-2009-11）

李積友，男，碩士，研究員，研究方向：動物遺傳育種；E-mail：youjili@sina.com

杜曉華，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：基礎獸醫學和動物發育生物學；E-mail：duxh@gsau.edu.cn