犬α干擾素在家蠶桿狀病毒表達系統中的表達及其抗病毒活性的測定

李皓洋胡小元易詠竹楊鑫張志芳李軼女

（1.中國農業科學院生物技術研究所，北京100081；2.中國農業科學院蠶業研究所，鎮江 212018）

犬α干擾素在家蠶桿狀病毒表達系統中的表達及其抗病毒活性的測定

李皓洋1胡小元1易詠竹2楊鑫1張志芳1李軼女1

（1.中國農業科學院生物技術研究所，北京100081；2.中國農業科學院蠶業研究所，鎮江 212018）

犬α干擾素（CaIFNα）在犬病防治過程中應用廣泛。旨在開發一種高效的CaIFNα表達方法。首先按家蠶密碼子的偏好性對GenBank中的一個CaIFNα基因進行了優化與合成，將其克隆到桿狀病毒轉移載體pVL1393中，并與親本病毒BmBacmid共轉染家蠶細胞進行細胞內重組。得到的重組病毒用于感染家蠶幼蟲，收集發病幼蟲的蠶血淋巴用于CaIFNα檢測。采用細胞病變抑制法在MDCK-VSV*GFP系統中測定其抗病毒活性。結果顯示家蠶表達的CaIFNα能有效抑制VSV*GFP在細胞內的復制，其抗病毒活性不低于1.78×106U/mL。

犬α干擾素；家蠶桿狀病毒表達系統；抗病毒活性檢測

干擾素（Interferon，IFN）是一類具有抗病毒活|性、調節細胞增殖分化和免疫調節作用等多種生理活性的細胞因子，在自然免疫以及適應免疫中都發揮著重要作用。IFN于1957年由Isasscs等［1］在進行流感病毒感染雞胚的實驗中首先發現，隨后逐漸成為國內外學者的研究熱點。IFN因其抗病毒、抗腫瘤和抗寄生蟲等功效［2-4］，一直被當作一種廣譜性治療藥物使用。而天然干擾素的含量非常稀少，而且提取純化的成本高昂，極大地制約了其廣泛應用。因此，應用基因工程手段表達高活性的干擾素產品，一直以來都是生命科學研究的熱點問題。

隨著我國犬飼養量逐年升高，隨之而來的疾病問題也日趨嚴重?？袢?、犬細小、犬瘟熱等病毒性疾病已經成為制約犬飼養業發展的主要疾病，并且時常引起人類感染，嚴重威脅人類健康和社會安全。CaIFN在多種犬病毒性疾病的防治過程中發揮了重要作用。CaIFN的研究開始于20世紀80年代，Himmler等［5］用人IFNα的探針從犬基因組中克隆出了CaIFNα的基因，并利用大腸桿菌對CaIFNα進行了原核表達，最后得到了抗病毒活性為3×105U/L的CaIFNα產物。這是對CaIFN研究的首次報道。1992年Devos等［6］用鼠的IFNγ探針從犬基因組中克隆出了CaIFNγ基因，并成功將CaIFNγ在中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）中進行了表達，得到了有抗病毒活性的CaIFNγ產物。之后，人們又利用基因工程手段在多種表達體系中對犬干擾素進行了表達，并且取得了一系列的表達產品用于犬類疾病的預防和治療［7，8］。

CaIFN在多種犬類疾病的預防和治療過程中都發揮著重要作用。王紅等［9］給患病毒性腸炎的實驗組病犬注射CaIFNα發現，其發病癥狀明顯減輕，并且癥狀持續時間明顯縮短，說明CaIFNα在犬病毒性腸炎的治愈過程中發揮了重要作用。王忠海等［10］將CaIFN用作人用狂犬疫苗的佐劑，注射小鼠后發現CaIFN能誘導中和抗體更早、更多的產生，說明CaIFN在疫苗制備方面有極大的應用潛力。與CaIFN的巨大應用潛力相比，目前市場中的CaIFN制劑的供應量卻略顯不足，一些犬類疾病，如犬過敏性皮膚炎［11］等仍用貓干擾素進行治療。因此，簡單、高效、安全的CaIFN表達方法的研究具有重要價值。

CaIFNα是治療犬病毒病的主要藥物，其主要作用原理是通過增加MHCⅠ類分子的表達，從而增強細胞毒性T細胞對其靶細胞的殺傷作用，同時增加自然殺傷細胞（NK細胞）的裂解潛能，使機體能有效地抵御外源病毒的感染［12］。利用基因工程手段表達CaIFNα具有可觀的研究價值和應用前景。本研究將CaIFNα在家蠶桿狀病毒表達系統中進行表達，并在犬細胞系中檢測其抗病毒活性，以期開發一種高效的CaIFNα表達手段。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌感受態Trans I由北京全式金生物技術有限公司提供。載體構建過程中用到的限制性內切酶購自Promega公司。昆蟲細胞培養基（TC-100）購自AppliChem公司。哺乳動物細胞培養基（高糖DMEM），胎牛血清（FBS）購自Gibco公司。CaIFNα基因由南京金斯瑞生物科技有限公司優化合成。桿狀病毒轉移載體pVL1393、犬腎細胞（MDCK）、家蠶細胞（Bm-N）、ORF1629缺損的親本桿狀病毒BmBacmid（專利號：201110142492.4）和表達綠色熒光蛋白的水皰性口炎病毒（VSV *GFP）均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 CaIFNα基因的優化和合成 本研究選取GenBank中的一條CaIFNα基因序列（HQ680864.1），根據家蠶的密碼子偏好性對基因核苷酸序列進行了優化改造，在不改變蛋白序列的前提下，優化處理了可能影響蛋白表達與折疊的因素，如GC含量、mRNA的二級結構等，以提高CaIFNα基因在家蠶體內的表達效率。在優化好的CaIFNα基因序列起始密碼子前添加了Kozak序列，以提高CaIFNα在真核表達體系中的表達效率。此外，為了方便后續的克隆實驗，在CaIFNα的5'末端和3'末端分別添加了的BamHⅠ和XbaⅠ位點。CaIFNα序列由南京金斯瑞公司優化合成，并連接到pUC57載體上，形成pUC57-CaIFNα。

1.2.2 轉移載體pVL-CaIFNα的構建 將pUC57-CaIFNα進行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切處理，回收目的基因CaIFNα片段。將得到的CaIFNα與同樣用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切處理的桿狀病毒轉移載體pVL1393連接，連接后的質粒轉化大腸桿菌感受態Trans I。挑取單菌落提取質粒，并進行酶切鑒定，選取含有目的基因的質粒送北京擎科新業生物技術有限公司測序，測序結果與預期結果一致的質粒命名為pVL-CaIFNα。

1.2.3 重組病毒的共轉染及篩選 采用脂質體介導法將pVL-CaIFNα與線性化的親本病毒DNA共轉染Bm-N細胞，使其在細胞內進行重組［13］。共轉染后將Bm-N細胞置于27℃環境中培養6 h，棄上清，補加含10% FBS的TC-100培養基，在27℃環境中繼續培養。連續觀察約4-5 d，待細胞病變浮起后，收集上清液，得到重組病毒。將重組病毒液按105pfu/頭的劑量接種五齡起蠶，待家蠶發病后，收集蠶血淋巴，得到家蠶表達產物，-20℃保存。

1.2.4 CaIFNα抗病毒活性的鑒定 采用細胞病變抑制法［14］，利用MDCK-VSV*GFP系統檢測家蠶表達的CaIFNα的抗病毒活性。樣品以10倍稀釋度做梯度稀釋，共5個稀釋度，每個稀釋度設6個重復。每個細胞孔加入處理后的樣品100 μL，攻毒100TCID50。同時設置病毒對照組（只加病毒不加干擾素）和空白對照組（不加病毒和干擾素）。攻毒24 h后，觀察細胞病變情況，根據綠色熒光蛋白的表達量來評估細胞的病變水平。

2 結果

2.1 合成質粒pUC57-CaIFNα的酶切鑒定

對南京金斯瑞公司優化合成的pUC57-CaIFNα質粒，進行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定。經電泳分離后，出現了一條大小約為600 bp的條帶（圖1）。CaIFNα的基因為564 bp，預期結果與實驗結果一致。經測序分析表明CaIFNα序列合成無誤，可用于進一步的實驗。

圖1 合成質粒pUC57-CaIFNα的酶切鑒定

2.2 重組轉移載體pVL-CaIFNα的酶切鑒定

目的基因CaIFNα片段與經雙酶切pVL1393載體連接后，轉化大腸桿菌感受態，挑取單菌落提取質粒后，用BamHⅠ和XbaⅠ對質粒進行雙酶切鑒定，經電泳分離后，出現于預期結果大小相似的目的條帶（圖2）。將含有目的條帶的重組質粒進行測序，測序分析表明CaIFNα已正確連接到pVL-1393中。

圖2 重組轉移載體pVL-CaIFNα的酶切鑒定

2.3 CaIFNα抗病毒活性檢測

利用細胞病變抑制法測定表達的CaIFNα的抗病毒活性，攻毒大約24 h后，觀察到空白對照組細胞生長狀態正常，無熒光出現，實驗組加入高濃度干擾素的細胞孔病毒復制被完全抑制，無熒光（圖3-A），當干擾素稀釋到105倍時，部分細胞孔出現細胞病變，但病變程度仍明顯小于病毒對照組，說明該稀釋度下干擾素已無法完全抑制病毒復制，但仍有明顯的抑制作用（圖3-B），病毒對照組所有細胞孔都出現熒光（圖3-C）。出現綠色熒光的細胞孔即記為細胞病變，記錄細胞病變情況（表1），統計病變孔與非病變孔的個數，按照Reed-Muench法計算干擾素的效價。選取多次重復測定結果中的較有代表性的一次數據進行計算和分析，計算其效價至少可達1.78×106U/mL。

3 討論

隨著養犬業規模的不斷擴大，犬類疾病對人類健康的影響也越來越嚴重。CaIFNα作為一種具有廣譜抗病毒、細菌和寄生蟲活性的生物制劑，在犬類疾病的預防與治療方面有廣闊的應用前景。CaIFNα的高效表達一直是生命科學的一個研究熱點，目前，CaIFNα已在多種表達體系內得到表達。隨著外源蛋白表達技術越來越成熟，如何進一步簡化生產工藝，降低生產成本，提高外源蛋白的生物活性將是今后蛋白表達技術發展的方向。

圖3 利用MDCK/VSV*GFP 系統檢測家蠶表達的CaIFNα的抗病毒活性

表1 家蠶表達的CaIFNα抗病毒活性檢測

大腸桿菌作為一種傳統的外源蛋白表達工具，因其遺傳背景清楚、培養周期短、目的基因表達水平高等優點一直被廣泛使用。殷玉和等［15］合成了編碼CaIFNα的基因片段，在大腸桿菌中進行誘導表達。表達產物經純化后利用MDCK-VSV系統進行了檢測，測定純化后CaIFNα蛋白的比活為3×107U/mg。畢赤酵母作為一種真核表達工具，具有翻譯后修飾的功能，能使表達的外源蛋白正常的進行糖基化等修飾，有利于提高外源蛋白的活性，因此也常被用于干擾素的表達。王玉等［16］將經過密碼子優化的CaIFNα基因在畢赤酵母內表達，得到最高活性為1.58 × 108U/mg的CaIFNα產品。但外源蛋白在大腸桿菌中的表達產物經常形成包涵體，不具備有效的生物活性，要獲得具有活性的蛋白質需要經過變性復性等一系列過程，操作復雜且成本高昂；在畢赤酵母中的表達也面臨復雜的純化過程，這不可避免地增加了干擾素的生產工序和生產成本。桿狀病毒表達系統是一種優秀的真核表達系統，具有高安全性，高表達量和良好的外源蛋白翻譯后加工修飾功能等優點，在高活性真核蛋白表達過程中被廣泛采用［17］。故本研究選用家蠶-桿狀病毒表達系統來進行CaIFNα的表達。

由于不同物種中密碼子的使用存在偏好性，因此采用PCR法直接克隆的功能蛋白的DNA序列，在異源宿主體內表達時經常面臨蛋白表達量低，活性差等一系列問題。密碼子偏好性優化是提高異源蛋白表達量的有效手段［18］。Zhou等［19］在利用哺乳動物細胞表達牛乳頭瘤病毒的衣殼蛋白時，通過密碼子優化，使表達量提高了1 000多倍。因此，本實驗根據NCBI中的CaIFN-α基因序列，按家蠶密碼子偏好性對其進行優化。同時，在優化過程中去除了mRNA二級結構，重復序列等不利于蛋白表達的因素，然后采取化學合成法合成用于表達的完整的CaIFNα序列，以期使CaIFNα在家蠶細胞內得到良好表達。

在進行CaIFNα抗病毒活性測定時，本研究采用了重組VSV*GFP病毒，該病毒感染細胞后可以在細胞中復制，并產生綠色熒光蛋白，通過觀察熒光的有無即可確定細胞是否被病毒感染［20］。有效避免了用普通VSV測定干擾素活性時細胞病變不明顯，觀察結果偏差大的問題，大大提高了檢測的靈敏度與結果的可靠性。經多次重復實驗，測得家蠶表達的CaIFNα抗病毒活性基本穩定，抗病毒活性不低于1.78×106U/mL。

4 結論

本研究對犬α干擾素基因進行合理的優化設計，并成功表達出具有良好抗病毒活性的CaIFNα，每毫升蠶血淋巴中CaIFNα的抗病毒活性不低于1.78×106U，為低成本、高活性的CaIFNα生物制劑的高效制備提供了一種有效途徑。

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（責任編輯 李楠）

Expression of Canine Interferon Alpha in Silkworm-baculovirus Expression System and the Antiviral Activity Assay

Li Haoyang1Hu Xiaoyuan1Yi Yongzhu2Yang Xin1Zhang Zhifang1Li Yinü1
（1. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；2. The Sericultural Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhenjiang 212018）

Canine interferon alpha（CaIFNα）was widely used in the prophylaxis and cure of canine diseases. The purpose of this study is to develop an efficient method to express CaIFNα. A canine interferon alpha gene in GenBank was optimized according to the codon bias of silkworm and synthesized， and then cloned into the baculovirus transfer vector pVL1393 to construct the recombinant plasmid pVL-CaIFNα. The pVL-CaIFNα was co-transfected with the BmBacmid DNA into silkworm cells and after in vivo recombination. The recombinant virus was gathered and used to infect silkworm larvae. The hemolymph of infected larvae was collected for antiviral activity assay. The antiviral activity of expressed CaIFNα was examined on Madin-Darby canine kidney cells infected with the vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein（VSV*GFP）. The result showed that CaIFNα expressed in silkworm can inhibit the multiplication of VSV*GFP and the antiviral activity was about 1.78×106U/mL.

canine interferon alpha；silkworm-baculovirus expression system；antiviral activity assay

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.022

2015-03-17

國家高技術研究發展計劃“863”計劃（2011AA100603），國家重點基礎研究發展計劃“973”計劃（2012CB114600）

李皓洋，男，碩士，研究方向：昆蟲桿狀病毒表達系統；E-mail：815579279@qq.com

李軼女，女，博士，副研究員，研究方向桿：桿狀病毒表達系統；E-mail：liyinv@caas.cn