微量熱泳動技術原理及其在研究生物分子互作方面的應用

艾秋實曹向宇趙芊牛亞利，4宋水山

（1. 河北省科學院生物研究所，石家莊 050081；2. 河北農業大學生命科學學院，保定 071001；3.河北省主要農作物病害微生物控制工程技術研究中心，石家莊 050081；4.河北工業大學化工學院，天津 300130）

微量熱泳動技術原理及其在研究生物分子互作方面的應用

艾秋實1，2，3曹向宇1，3趙芊1，3牛亞利1，3，4宋水山1，3

（1. 河北省科學院生物研究所，石家莊 050081；2. 河北農業大學生命科學學院，保定 071001；3.河北省主要農作物病害微生物控制工程技術研究中心，石家莊 050081；4.河北工業大學化工學院，天津 300130）

微量熱泳動（MST）技術是近年來興起的一項用于研究生物分子間互作的新技術。其檢測是基于熱泳動現象，即分子在溫度梯度中的定向運動及由此引起分子性質的變化，如分子大小、電荷和水化層及構象等。該方法把精確的熒光檢測與靈敏的熱泳動相結合，從而提供了一個靈敏的、快速的精確分析生物分子間互作的檢測方法。就MST的工作原理和檢測過程及其在生物學研究中的應用作以綜述。

微量熱泳動；互作分析；結合性研究；生物分子間互作

研究生物分子的相互作用，對于探明生物體信號轉導通路及調控機制、生理生化代謝途徑具有重要意義。在生命科學研究中，人們經常利用熒光分子追蹤和分析分子間的相互作用。這是因為熒光相關技術在研究生物學過程中起到了極其重要的作用［1］。多種顯微技術可對細胞內的熒光分子進行觀察，而且在體外實驗中也可應用熒光分子。無論是檢測結合常數和酶活，還是研究蛋白質折疊的熱力學機制都能使用熒光分子相關技術對生物分子運動過程的生物物理學參數進行測定。在過去幾十年中，熒光技術作為一種體外檢測方法幫助人們認識了生物分子諸多方面的功能。這是由于熒光技術具有應用廣泛、特異性好、靈敏度高的優點［2］。

利用熒光技術分析生物分子間互作，主要依靠檢測系統的性能、熒光猝滅機理、熒光光譜［3］、異向性或福斯特（Foerster）共振能量轉移來分析某個反應的平衡常數。然而，這些技術還存在一定的局限性，如需要依賴分子的大小，結合時分子大小的變化和熒光團相互作用時相對位置等參數［4］。另外，這些技術具有樣品用量大，實驗步驟繁瑣，數據分析不精確等缺點。

基于熒光檢測技術的優勢，微量熱泳動（microscale thermophoresis，MST）技術將熒光檢測與熱泳動現象相結合，提供了一個高效、精確、靈敏的檢測方法。MST檢測通常需要用熒光標記蛋白，配體則不需要標記。在溫度梯度中，熒光標記蛋白與配體發生熱泳動，導致反應體系中熒光分布發生變化。MST就是通過檢測溫度梯度場中，分子熱泳動引起的熒光分布變化來分析分子間相互作用。

1 MST基本介紹

1.1 基本原理

熱泳動現象由 Ludwig首次闡釋，指在溫度梯度下分子的定向運動［5］。2010年，Wienken 等［6］首次報道了利用MST技術研究蛋白質及小分子在生物溶液中的相互作用，此項技術的興起是研究生物分子間互作領域的一場革命。MST檢測設備由Nano Temper公司發明，其工作原理是生物分子在毛細管中發生熱泳動現象，導致發生相互作用的生物分子的水化層、分子大小、電荷等分子性質發生改變，進而引起反應體系中熒光分布的變化，以檢測相互作用的生物分子間的親和性。

MST生物物理學背景已經有了廣泛的報道［7-10］。反應體系中的溫度變化（ΔT）可導致溫度升高區域中粒子數量減少。通過索雷特（Soret）系數對熱泳動進行定量分析 ST：Chot/Ccold=exp（-STΔT）。熱泳動的減弱是由于分子與溶劑交界面相互作用導致的。在緩沖液不變的情況下，熱泳動可分析分子的大小、電荷和溶劑熵值。如蛋白質與蛋白質-配體復合物的熱泳動是有顯著差異的，復合物形成后會引起分子大小、電荷和溶劑能量的改變。即使結合后不能顯著改變蛋白大小、電荷，MST仍可通過檢測溶劑熵值的變化來檢測結合是否發生［10］。MST除了能精確檢測生物分子間相互作用，計算解離常數（Kds），還能得到有關生物分子互作的其他參數。

1.2 性能優勢

長期以來，測定生物分子間的結合情況一般使用生物化學的方法。因其能直接呈現檢測結果，而且操作簡單、成本低。常用的生物化學方法包括，用于檢測蛋白與核酸相互作用的凝膠遷移實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），以及基于抗體的檢測技術，如酶聯免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）［11，12］。盡管這些檢測方法應用廣泛，但很難對結合情況進行精確分析［13］。

生物物理學的方法可對生物分子的結合情況進行定量研究。然而目前應用較多的一些檢測方法也存在著局限性。如等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）雖然無需標記和固定樣品，但其靈敏度較低，且需要較多的待測樣品產生明顯的熱信號用于檢測，這就加大了樣品制備的難度［14］。動態光散射法（dynamic light scattering，DLS）也是免標記、免固定樣品的方法，但其檢測依靠未結合組分與結合復合體之間水動力半徑（rH）的明顯差異，這限制了檢測的范圍［15］。熒光偏振技術（flourscence polarization，FP）盡管無需固定樣品，但其適用性和靈敏性受熒光染料的壽命、熒光標記配體的大小以及配體結合后分子質量變化的影響。該方法使用的熒光染料為熒光素，其壽命短，分子量普遍大于0.3 kD，這會影響配體的結合運動［16，17］。表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）法靈敏度高，可實時獲取檢測數據。但其需要將樣品固定，這會影響結合分子的動力學特性進而影響結合反應發生［18］。而MST技術則避免了上述實驗技術的不足。

MST能對微升（μL）級的溶液進行檢測，這不完全取決于待測分子的大小變化和物理特性［6，9，19］。MST的檢測主要基于生物分子水化層的改變，所以比其他的熒光技術應用范圍廣［7，8］。因此，MST不會像FP技術那樣，需要改變待測分子的大小和質量，同時避免了DLS受制于結合組分的分子質量比。另外，MST不用固定樣品，且樣品用量極少，這是ITC、SPR等非熒光檢測法所不具備的優勢。而且細胞質、細胞裂解液等復雜生物溶液可作為MST檢測的反應體系［6，10］。

根據檢測器不同MST檢測設備分為Monolith NT.115/Monolith.NT115Pico和 Monolith NT.LabelFree。使用Monolith NT.115/Monolith.NT115Pico型號檢測時需要對其中一個待測分子進行熒光標記。Monolith NT.LabelFree的出現為研究生物分子互作提供了一個完全免標記的檢測方法［20］，這是因為它能檢測到蛋白質自身所含芳香類氨基酸發出的內源熒光。另外Monolith NT.Automated結合了上述兩種類型檢測器的特性，所以具備高通量篩選的能力。

綜上所述，MST與其他方法相比具有以下幾方面優點：（1）可在多種生物溶液中進行檢測；（2）實時獲取檢測數據；（3）靈敏度極高；（4）樣品處理簡單；（5）檢測時間短；（6）待測樣品用量極少。

1.3 解離常數的計算

Kds是通過MST測得的重要參數。Kds是反應分子間親和力的重要指標。它被定義為：

Kds：解離常數；［A］free：游離態A組分濃度；［B］free：游離態B組分濃度；［AB］：A與B結合后形成的復合體濃度。

但兩個結合組分的游離態濃度無法測得。所以，以它們的總濃度替代。它們的總濃度分別被定義為：［A］=［A］free+［AB］和［B］=［B］free+［AB］

因此Kds被定義為：

下面將A定義為滴定組分，即配體。B定義為與A結合的另一組分，即受體。其濃度保持不變，熒光值可被儀器讀出。由此解出B的結合率（FB）即可求得Kds。FB為：

MST設備給出的Fnorm是關于FB的線性函數，因此由上述等式可得出Fnorm［21］。

2 MST檢測過程

除了使用Monolith NT.LabelFree外，MST檢測要對其中一個互作分子進行熒光標記且濃度不變，而非熒光標記的分子進行倍比稀釋，根據儀器的規格最多可做15個濃度梯度。因此MST檢測主要涉及熒光標簽選擇，結合配體的倍比稀釋和毛細管3方面的問題。MST的檢測過程，如圖1所示。

2.1 熒光標簽

除Monolith NT.LabelFree型外，MST的激發光波長處于可見光范圍內，所以要對待測分子進行熒光標記才能檢測其熱泳動現象，如熒光標簽、融合熒光蛋白。生物分子存在結合標簽位點，它的結合并不影響熱泳動的產生。此外，隨機結合的標簽有利于MST的檢測。因為在結合過程中能降低單個標簽的局部效應。熒光物質與目的分子偶聯需要特定的pH值，大部分蛋白質都可適應這一條件。除了蛋白質，其他生物分子也可利用熒光標簽進行相互作用的研究。

熒光標記法要針對目標蛋白選擇特定的熒光標簽。在體外表達系統中，可將嘌呤毒素熒光團與C端結合［23］，也可與攜帶熒光染料的非天然氨基酸結合［24］，或是結合后對其進行特殊修飾［25］。另外，細胞裂解液中可直接使用重組蛋白，如綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），或是針對特定染料的結合位點選用肽段序列標簽。

熒光標簽提供了一種高靈敏的檢測方法，可用于納摩（nmol）水平的檢測。該方法能檢測復雜液體環境中帶有不同標簽的混合分子。然而熒光標簽可能會影響分子間的結合，像G蛋白偶聯受體等膜蛋白對于修飾比較敏感。所以在選擇熒光標簽時，要考慮被標記生物分子的性質，核酸、蛋白質的結構與性質不同，它們需要的熒光標簽也不同。通過使用Monolith NT.LabelFree型儀器可解決此問題，該儀器在紫外條件下檢測蛋白質自身含有的芳香類氨基酸發射的熒光，如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

選擇熒光源時，要考慮MST檢測時所用緩沖液的性質，使得緩沖液的背景熒光值在熒光團特定波長下產生盡可能小的信噪比。因此，在細胞裂解物或血清等復雜生物溶液中必須采用熒光標簽，因為生物溶液含有較高濃度的蛋白質會產生較高的紫外熒光值。

圖1 MST檢測過程［22］

2.2 倍比稀釋

一般初始熒光強度是恒定的，除非熒光團接近結合位點或出現表面吸附和聚集情況。為驗證這些情況是否對檢測產生影響，應用去垢劑或小牛血清蛋白（BSA）等作為陰性對照。因為蛋白質紫外范圍內背景熒光值是不容忽視的，所以免標記的MST檢測應設置陰性對照，以扣除本底信號的干擾。通過倍比稀釋的方法，將不同濃度的非熒光標記反應物與固定濃度的熒光標記反應物混合。前者的最低濃度為游離狀態下儀器能檢測到其熱泳動的發生，最高濃度要高于預期的Kds，以及與熒光標記反應物完全結合時所需的濃度。通常認為最高濃度是Kds的20倍左右。

2.3 毛細管

將待測樣品通過毛細管現象吸到不同的毛細管中。4 μL樣品就能滿足測試的需要。MST實驗所用毛細管的內徑差距不會大于1 μm，以確保每根毛細管中產生一致的溫度梯度，因此毛細管內表面對實驗檢測結果至關重要。毛細管外層的厚度也影響著溫度梯度及總體溫度的增加，它的熱傳導性決定了遠離紅外線（IR-laser）照射區域的熱傳導效率。標準MST毛細管（nanotemper technologies）的內表面是高度均勻的，其背景信號很低。對于非特異吸附在毛細管表面的反應物，MST設備能輕易的檢測到，或利用BSA作為陰性對照以避免非特異吸附對實驗結果的影響。例如，對小分子物質檢測時，可利用BSA作為對照實驗以排除小分子的非特異結合。毛細管內表面也可進行親水或疏水處理。

3 MST在生物分子互作研究中的應用

近些年，MST已經成功的應用在研究生物分子間互作領域，主要包括寡聚核苷酸間的互作、蛋白質與DNA的互作、蛋白質與蛋白質的互作、蛋白質與小分子間的互作，以及蛋白質與脂質體的互作。

3.1 寡核苷酸相互作用的研究

適配體（aptamer）是體外篩選的能與特定目標分子結合的核苷酸序列，它與適配體-目標結合物產生的熱泳動現象具有顯著差異。Baaske等［26］利用Cy5染料標記核苷酸序列，定量分析凝血酶適配體與凝血酶的結合情況。他們發現在不同緩沖液中，適配體與目標物的親和性存在差異，在10%和50%血清中測得的結合常數與其他緩沖液中測得的不同，由此表明MST可對血清這樣復雜的生物溶液進行檢測，其檢測的靈敏度和特異性不受血清中其他組分的影響。他們還分析了ATP適配體在不同緩沖液中與AMP和ATP的結合情況。

分子穩定性和構象是生物分子重要的測量參數。Wienken等［27］通過測定核酸的熱泳動，精確檢測核酸的熔化相變和分解時構象變化。利用MST分析了單核苷酸的多態性、DNA修飾、DNA發卡結構和雙鏈小RNA的構象。他們把MST測得的結果與紫外吸收光譜法測得的結果進行比較發現，利用兩種方法測得的結果一致，證實了MST在核酸分析方面的可靠性。

3.2 蛋白質與核酸相互作用的研究

病毒非結構蛋白NSP5是構成病毒質的主要成分。Martin等［28］證實鐵硫簇在NSP5與ssRNA結合過程中發揮作用。用Cy-3標記ssRNA與野生型NSP5或缺少鐵硫簇的NSP5 C171A C174反應，以測得Kds。MST結果顯示，野生型NSP5有兩個結合位點可以結合ssRNA，且兩個結合位點的親和性不同。而NSP5 C171A C174只具有親和性較高的結合位點。

轉錄因子PU.1在造血系統發揮重要作用，在分化過程中PU.1的結合形式會發生明顯的改變。轉錄因子能夠識別并結合到基因組特定DNA序列。Pham等［29］通過體內外結合實驗和生物信息技術研究表明，PU.1選擇它的結合位點主要依靠與目的序列的親和性。他們利用MST技術檢測了75個Cy-3標記的DNA模體序列與體外表達PU.1的Kds發現，每個模體log-odds scores與Kds成反比，認為logodds scores能夠反應模體序列的親和力。

3.3 蛋白質與蛋白質相互作用的研究

泛素化信號被一整套泛素受體識別，Keren-Kaplan等［30］發現了一個可能與泛素結合的結構域ALIX-V。首先通過pull-down實驗證實ALIX-V與泛素具有較強的親和性，但SPR測得的Kds約為2 200 μmol/L，不能印證pull-down實驗的結論。利用MST技術測得Kds約為119 μmol/L，這一結果與多數泛素結合結構域特征相符。他們推測SPR與MST結果出現分歧的原因可能是泛素引起ALIX-V發生齊聚反應，SPR實驗需要把ALIX-V固定，而MST實驗并不需要將其固定。他們又通過MST實驗進一步驗證了其推測。

線粒體熱休克蛋白Hsp70的分子伴侶 Ssq1在鐵硫蛋白成熟過程中起著至關重要的作用。Ssq1與支架蛋白Isu1結合，以促進新合成的鐵硫簇從Isu1上解離，同時Ssq1轉移到目標載脂蛋白上。Uzarska等［31］證實Ssq1也可與硫醇谷氧還蛋白5（Grx5）結合，但是結合位點與Isu1不同。在MST實驗中使用Kit Red標記Grx5與Ssq1進行反應，計算出Grx5的親和常數。

3.4 蛋白質與小分子互作的研究

小分子物質可競爭單結構域酶的活化位點，抑制其蛋白功能，還可干擾兩個含單結構域酶的相互作用。tRNA-鳥嘌呤轉糖基酶（TGT）只有形成二聚體才能發揮作用，因此通過小分子物質抑制TGT形成二聚體是治療志賀桿菌病的新思路。為阻止TGT形成二聚體，Immekus等［32］根據TGT的結構特點設計了不同類型的配體。利用MST技術檢測Alexa Fluor 647標記的TGT與不同配體間的Kds。并通過［8-3H］鳥嘌呤動力學實驗驗證了所測得Kds。

G-蛋白介導的Rho鳥苷酸交換因子（GEF）-Rho GTPase信號軸參與人類的病理過程，它也是一個潛在的治療位點。Shang等［33］對能夠嵌入LARG（參與RhoA激活并受G蛋白調節的Rho GEF）的DH-PH結構域的化學物進行了篩選，并通過生化實驗發現以Y16為代表的一類化學抑制劑能夠特異的阻止LARG與RhoA結合。通過MST技術檢測Y16與Alexa Fluor 647標記的LARG作用時的 Kds，表明Y16能與LARG特異性結合。他們還用LARG不同位點的突變體與Y16反應，進一步明確了Y16與LARG的結合位點。

N-酰基高絲氨酸內酯（AHLs）是革蘭氏陰性細菌分泌的一類群體感應信號，并能影響植物體內多條信號通路［34］。因此尋找植物體內AHLs受體對進一步研究植物如何感應AHLs至關重要。本實驗室利用MST技術驗證擬南芥體內可能的AHLs受體G蛋白偶聯受體2（GCR2）是否作為某種AHLs的受體，即用Kit Red標記GCR2并與不同的AHLs分子進行結合實驗（未發表）。

3.5 蛋白質與脂質體互作的研究

突觸囊泡蛋白Synaptotagmin-1是神經元胞吐作用中重要的Ca2+感受器，它同時與Ca2+和帶陰離子的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）結合。但三者間的協同作用還并不十分清楚。Van Den Bogaart等［35］利用MST技術分析了PIP2和Ca2+與Synaptotagmin-1的結合情況。用Alexa Fluor 488標記Synaptotagmin-1及其突變體發現，PIP2與C2B結構域保守區域結合。當有較高濃度的PIP2存在時可以顯著提高Ca2+與C2AB的親和性。由此證明，在神經遞質釋放過程中，Ca2+、synaptotagmin-1和PIP2之間的相互作用十分緊密。

4 結語

研究生物分子間互作，對于明確生物信號轉導機制，生物分子的結構與功能等方面尤為重要。但如何證明兩個生物分子結合一直是生物學研究領域的重點和難點，一般需要用多個實驗共同驗證實驗結果的真實性、可靠性。MST技術的出現為研究生物分子間互作提供了一個新的方法。目前，MST與pull-down、液閃實驗等技術相結合，豐富了研究生物分子間互作的檢測方法，提高了檢測效率。除了上述提到的優勢外，MST還具有儀器維護及運行費用較低，儀器體積小等優點。但目前，MST的應用還有一定的局限性，其一、儀器價格昂貴；其二、不能直接確定結合的具體位點，只能通過使用該生物分子的突變體等方法加以確定。MST技術通過進一步的發展，一定會在細胞信號轉導、小分子配體篩選、分子靶向治療、醫藥研發等研究領域中發揮越來越大的作用。

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（責任編輯 狄艷紅）

Principle and Application of Microscale Thermophoresis in Studies of Biomolecular Interactions

Ai Qiushi1，2，3Cao Xiangyu1，3Zhao Qian1，3Niu Yali1，3，4Song Shuishan1，3
（1. Biology Institute，Hebei Academy of Sciences，Shijiazhuang 050081；2. College of Life Sciences，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001；3. Hebei Engineering and Technology Center of Microbiological Control on Main Crop Disease，Shijiazhuang 050081；4. College of Chemistry and Engineering，Hebei University of Technology，Tianjin 300130）

Microscale Thermophoresis（MST）is a new technique to study biomolecular interactions in recent years. It is based on thermophoresis， i.e.， the directional movements of molecules in a temperature gradient， which results in subsequent changes of molecular properties such as sizes， charges， hydration shell and conformation. MST combines the precise fluorescence detection and sensitive thermophoresis and provides a sensitive， fast and precise detection technique to analyze biomolecular interactions. Wor king principle， detection process and application of MST in biology researches are reviewed here.

microscale thermophoresis；interaction analysis；binding studies；biomolecular interaction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.010

2014-08-21

國家自然科學基金項目（31270880）

艾秋實，男，碩士研究生，研究方向：植物抗逆機理；E-mail：yingyangtt@163.com

宋水山，男，博士，研究員，研究方向：細胞信號傳導；E-mail：shuishans@hotmail.com