紅曲取樣方法再驗(yàn)證混合均一度偏差處理

北京北大維信生物科技有限公司（100094）王曉峰 孫玉鳳 鄧翀

我廠現(xiàn)紅曲生產(chǎn)工藝的批量由3500kg變更至4000kg，原紅曲取樣驗(yàn)證方案適用于紅曲生產(chǎn)工藝批量為3500kg，其所得結(jié)論“在生產(chǎn)過程中，出現(xiàn)容器改變、工藝控制參數(shù)改變或批量改變需要進(jìn)行再驗(yàn)證”。現(xiàn)通過再驗(yàn)證，確認(rèn)按照取樣操作規(guī)程所取紅曲批量為4000kg的紅曲樣品的洛伐他汀含量，能夠正確反映整批的待出料紅曲有效成分含量。評(píng)價(jià)取樣方法的有效性、代表性和科學(xué)性，為證明取樣方法的真實(shí)有效性提供基本依據(jù)。

紅曲取樣方法、取樣量按《中國(guó)藥典》（2010年版）第一部執(zhí)行。經(jīng)過風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，認(rèn)為：取樣量根據(jù)《藥典》規(guī)定公式計(jì)算隨批量擴(kuò)大，不存在風(fēng)險(xiǎn)；紅曲為分房間、分車、分瓶貯存，取樣方法采用對(duì)角線交叉取樣的方法，此方法已經(jīng)過3500kg的取樣驗(yàn)證，取樣量擴(kuò)大后，首先計(jì)算好取樣瓶數(shù)，再根據(jù)房間的布局合理選擇每車每列的取樣瓶數(shù)，可以保證取樣的代表性，不存在風(fēng)險(xiǎn)；原用于取樣時(shí)樣品混合的槽型混合機(jī)（設(shè)備型號(hào)CH100）不能滿足現(xiàn)有樣品混合量而采用新的取樣用槽型混合機(jī)（設(shè)備型號(hào)CH200），因而存在槽型混合機(jī)不能充分混合均勻紅曲的風(fēng)險(xiǎn)，和從槽型混合機(jī)中取出的紅曲樣品不能夠正確反映整批的待出料紅曲有效成分（洛伐他汀）含量的風(fēng)險(xiǎn)。

因此，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估得出的驗(yàn)證項(xiàng)目為：應(yīng)確認(rèn)所取紅曲樣品，在取樣用槽型混合機(jī)中可以充分混合均勻，從槽型混合機(jī)中取出的紅曲樣品能夠正確反映整批的待出料紅曲有效成分（洛伐他汀）含量。通過分析驗(yàn)證過程中樣品混合均一度測(cè)定數(shù)據(jù)（洛伐他汀含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差），最終驗(yàn)證我廠紅曲取樣方法在取樣量擴(kuò)大后，取樣用槽型混合機(jī)能保證樣品的混合均一度，能保證樣品的代表性。

本驗(yàn)證過程均按照我公司驗(yàn)證管理規(guī)程執(zhí)行，以下就驗(yàn)證實(shí)施過程、數(shù)據(jù)收集分析、驗(yàn)證結(jié)論等方面逐一闡述。

1 驗(yàn)證前準(zhǔn)備

附圖1 紅曲取樣流程圖

1.1 人員 所有參加紅曲取樣方法再驗(yàn)證的相關(guān)操作人員、驗(yàn)證管理人員和QA生產(chǎn)監(jiān)控員，在驗(yàn)證開始前應(yīng)進(jìn)行《紅曲取樣方法再驗(yàn)證方案》的培訓(xùn)，培訓(xùn)記錄納入培訓(xùn)檔案。

1.2 關(guān)鍵儀器、設(shè)備確認(rèn)檢查 開始本次取樣驗(yàn)證前，確認(rèn)相關(guān)的儀器和設(shè)備確認(rèn)已完成，且均符合要求，檢查結(jié)果記錄于《關(guān)鍵儀器、設(shè)備確認(rèn)檢查記錄》。

關(guān)鍵設(shè)備槽型混合機(jī)（設(shè)備型號(hào)CH200，以下簡(jiǎn)稱“槽型混合機(jī)”）容量200L，攪拌式混合方式，攪拌槳直徑540mm，電機(jī)功率4KW，倒料角度105°，攪拌轉(zhuǎn)速24r/min，重量550kg，出廠日期2003年12月，由江蘇瑰寶集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，設(shè)備情況良好，運(yùn)行正常，未進(jìn)行大修，已經(jīng)過容量核算和現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)證明能滿足4000kg紅曲濕料樣品的混合。

2 驗(yàn)證實(shí)施

2.1 取樣批次和取樣量

2.1.1 取樣量 因紅曲批量由3500kg變更為4000kg，按照《紅曲取樣SOP》（根據(jù)《藥典》制定）進(jìn)行最大量取樣，取樣量規(guī)定為：100＜瓶數(shù)N≤1000時(shí)，按5%取樣；瓶數(shù)N＞1000瓶時(shí)，前1000瓶按照上述方法確定取樣瓶數(shù)，超過部分按1%取樣，取樣瓶數(shù)計(jì)算若所得數(shù)值不是整數(shù)值，一律取比計(jì)算值大的第一個(gè)整數(shù)為準(zhǔn)。（引自參考文獻(xiàn)[1]）而4000kg紅曲最大可能瓶數(shù)為20133.3瓶。因此，總?cè)悠繑?shù)=50+（N-1000）×0.01=50+（20133.3-1000）×0.01=50+191.3=241.3（瓶）

向上取一位整數(shù)值，取樣242瓶。

2.1.2 取樣批次 選取紅曲連續(xù)三批4000kg批量的紅曲濕料，批號(hào)為H1、H2、H3。檢測(cè)合格后，每批取242瓶，用蒸汽滅菌器（1.0m3）進(jìn)行滅活處理用于驗(yàn)證。

2.2 取樣方法 取樣流程見附圖1。

2.2.1 整批紅曲的取樣 采用對(duì)角線法按隨機(jī)取樣原則取樣，直至取夠規(guī)定樣品瓶數(shù)。取出的紅曲從發(fā)酵瓶轉(zhuǎn)入槽型混合機(jī)混合。

2.2.2 槽型混合機(jī)內(nèi)的取樣 取樣部位的選定參照《藥品GMP指南》口服固體制劑關(guān)于混合設(shè)備混合均一度取樣的規(guī)定：“至少應(yīng)在上、中、下三個(gè)水平位置進(jìn)行多點(diǎn)取樣”。（引自參考文獻(xiàn)[2]）

取樣部位：CH200型槽型混合機(jī)的攪拌槳是半葉式對(duì)稱型，以軸為中心進(jìn)行旋轉(zhuǎn)攪拌，其與中心軸不同水平面的倉(cāng)內(nèi)四角（中心軸平面上層2角，下層2角）及雙葉的對(duì)稱中心點(diǎn)為易聚積物料處、混合效果最差，為取樣點(diǎn)。

附圖2 H3批洛伐他汀含量數(shù)據(jù)方差分析

2.3 取樣 運(yùn)行槽型混合機(jī)（速度24轉(zhuǎn)/分鐘），分別在混合的第1、2、3、4分鐘進(jìn)行取樣。對(duì)倉(cāng)內(nèi)4角和中心點(diǎn)分別取樣約60g，由QA生產(chǎn)監(jiān)控員用取樣勺在槽型混合機(jī)中心軸的中心點(diǎn)處取樣，然后放入取樣袋中記為取樣點(diǎn)3；用取樣勺緊貼料斗倉(cāng)內(nèi)四角，然后將物料取出，將取樣勺中的樣品放到取樣袋中，分別記為取樣點(diǎn)1、2、4、5；每個(gè)位點(diǎn)樣品取3份（1份檢驗(yàn)，2份備份），備份樣品存放在QC理化冰箱內(nèi)。QC檢驗(yàn)人員按照紅曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用高效液相色譜法檢測(cè)樣品中的洛伐他汀的含量，將結(jié)果記錄。

2.4 驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn) 槽型混合機(jī)每分鐘混合后5個(gè)取樣點(diǎn)之間液相含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD應(yīng)≤5.0%，最終以三批均能滿足上述條件的混合時(shí)間為槽型混合機(jī)的樣品混合時(shí)間。

3 數(shù)據(jù)收集與分析

3.1 三批次驗(yàn)證數(shù)據(jù)見附表1。

3.2 數(shù)據(jù)分析 H1批、H2批通過數(shù)據(jù)表明槽型混合機(jī)的混合3分鐘能保證混合均勻；H3批數(shù)據(jù)超過預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)，為偏差。

3.3 偏差分析

3.3.1 H3批洛伐他汀含量數(shù)據(jù)見附表2。

3.3.2 方差分析 使用JMP（版本10）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，α水平0.05，使用完全析因模型（模型效應(yīng)：取樣點(diǎn)，取樣次數(shù)（以混合時(shí)間區(qū)分），取樣點(diǎn)*取樣次數(shù)（以混合時(shí)間區(qū)分），（方法出自參考文獻(xiàn)[3]）。結(jié)果及解釋如下（見附圖2）。

從分析可見，取樣點(diǎn)、取樣次數(shù)、取樣點(diǎn)與取樣次數(shù)交互作用的效應(yīng)產(chǎn)生的變異對(duì)于誤差項(xiàng)并不顯著，因此，本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變化可認(rèn)為由其他誤差項(xiàng)引起。

3.3.3 誤差項(xiàng)分析 取樣方法驗(yàn)證過程中，導(dǎo)致數(shù)據(jù)變異的因素，應(yīng)為：樣品均勻度、檢驗(yàn)精密度，而《紅曲取樣方法再驗(yàn)證方案》中規(guī)定的“5個(gè)取樣點(diǎn)之間液相含量相對(duì)偏差RSD應(yīng)≤5.0%”，僅考慮了混合不均勻造成的變異。

檢驗(yàn)精密度為1個(gè)樣品6次檢驗(yàn)相對(duì)偏差RSD應(yīng)≤3.0%，結(jié)論來(lái)自《LC-20A高效液相色譜儀再確認(rèn)報(bào)告》。所以，應(yīng)同時(shí)考慮混合不均勻造成的變異和檢驗(yàn)精密度造成的變異。

3.4 偏差處理

3.4.1 偏差處理原理 根據(jù)中心極限定理，從正態(tài)分布的總體取若干樣品，亦呈正態(tài)分布；以樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差代替總體分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以樣本均值、樣本標(biāo)準(zhǔn)差形成新的統(tǒng)計(jì)量t服從t分布。

利用t分布的覆蓋因子k表（t分布的雙側(cè)分位數(shù)表），以樣本量n的大小不同情況下對(duì)樣本平均值的預(yù)測(cè)區(qū)間進(jìn)行估計(jì)。本案例中取樣是從被混合的產(chǎn)品這一正態(tài)總體中進(jìn)行抽取的，洛伐他汀含量檢驗(yàn)是對(duì)同一樣品多次檢驗(yàn)且在《LC-20A高效液相色譜儀再確認(rèn)報(bào)告》確認(rèn)檢驗(yàn)結(jié)果的正態(tài)性的，因此，樣本均值的預(yù)測(cè)區(qū)間均可以使用t分布進(jìn)行估計(jì)（方法自參考文獻(xiàn)[4]）：

附表1 槽型混合機(jī)內(nèi)5個(gè)取樣點(diǎn)之間洛伐他汀含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）

附表2 H3批洛伐他汀含量數(shù)據(jù)

附表3 液相含量相對(duì)偏差RSD標(biāo)準(zhǔn)的修改

x為樣品檢測(cè)值；X為樣品平均值；σ為樣本相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；k為n個(gè)樣品的t分布的覆蓋因子（90%置信度）

《藥典》2010年版附錄X E含量均勻度檢查法使用90%置信度估計(jì)含量均勻的置信區(qū)間，因此使用90%置信度。（引自參考文獻(xiàn)[1]）

若樣品均勻度造成的變異數(shù)據(jù)的t分布為RSD1，檢驗(yàn)精密度造成的變異數(shù)據(jù)的t分布為RSD2，根據(jù)方差性質(zhì)，此2總體合成的總體中樣本的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差σ為：

3.4.2 處理過程 紅曲取樣方法再驗(yàn)證混合均一度樣品的液相含量相對(duì)偏差RSD標(biāo)準(zhǔn)的修改如附表3所列。

《藥品GMP指南》口服固體制劑規(guī)定：“混合均一度應(yīng)該控制在85%～115%或更嚴(yán)格的工藝指標(biāo)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不應(yīng)高于7.8%” （引自參考文獻(xiàn)[2]），因此x∈ [85%X，115%X]。由(4-1)，即X*（1±2.13σ）∈ [85%X，115%X]，計(jì)算得σ≤7.04%，可見σ同時(shí)滿足《藥品GMP指南》“相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不應(yīng)高于7.8%”的規(guī)定。

故在驗(yàn)證混合均一度時(shí)，應(yīng)同時(shí)考慮混合不均勻造成的變異、檢驗(yàn)精密度造成的變異，并宜根據(jù)“混合均一度應(yīng)該控制在85%～115%或更嚴(yán)格的工藝指標(biāo)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不應(yīng)高于7.8%”的規(guī)定制定驗(yàn)證數(shù)據(jù)總體的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的標(biāo)準(zhǔn)。本次驗(yàn)證以不增加相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的原則進(jìn)行調(diào)整為：±7.0%，即相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)定為RSD≤7.0%。

3.4.3 偏差處理結(jié)論 偏差經(jīng)分析并做調(diào)整樣品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)的處理后，偏差可接受。根據(jù)RSD≤7.0%的標(biāo)準(zhǔn)，H1、H2、 H3數(shù)據(jù)表明槽型混合機(jī)（設(shè)備型號(hào)CH200）混合2分鐘均能保證混合均勻。為保證混合時(shí)間余量，取混合時(shí)間為3分鐘。

4 結(jié)論

通過對(duì)紅曲取樣方法進(jìn)行再驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果無(wú)遺漏，已對(duì)偏差進(jìn)行合理說明；不需要進(jìn)一步補(bǔ)充試驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)施過程中對(duì)驗(yàn)證方案有1處修改：“槽型混合機(jī)每分鐘混合后5個(gè)取樣點(diǎn)之間液相含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD應(yīng)≤5.0%”，改為“槽型混合機(jī)每分鐘混合后5個(gè)取樣點(diǎn)之間液相含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD應(yīng)≤7.0%”。最終證實(shí)：驗(yàn)證結(jié)果真實(shí)有效，取樣時(shí)可以使用槽型混合機(jī)（設(shè)備型號(hào)CH200）混合，混合速度24轉(zhuǎn)/分鐘，混合時(shí)間3分鐘；紅曲（4000kg）的取樣方法取得的樣品，能夠代表整批紅曲的真實(shí)含量。

根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果，將《紅曲取樣操作程序》變更如下：由“槽型混合機(jī)（設(shè)備型號(hào)CH100，設(shè)備編碼XXXX）混合3分鐘”變更為“槽型混合機(jī)（設(shè)備型號(hào)CH200，設(shè)備編碼XXXX）混合3分鐘”。操作程序變更后，對(duì)QA取樣人員進(jìn)行培訓(xùn)，以保證驗(yàn)證結(jié)論的執(zhí)行。