食品中雙歧桿菌計數LGC能力驗證結果與分析

北京市藥品檢驗所（北京市保健食品化妝品檢驗中心）（100035）王似錦 劉文杰 張光華 牛振東 井良義 江志杰 高春

北京市藥品檢驗所（北京市保健食品化妝品檢驗中心）微生物室近些年參加了多項國內和國際的能力驗證，均取得了滿意的結果。此次，本室參加了由英國LGC（Laboratory of the Government Chemist政府化學家實驗室）組織的食品成分及微生物檢測（QSM-Quality in Microbiology PT）的第219輪第27號雙歧桿菌的計數試驗（27 Bifidobacterium），并獲得了滿意的結果。下面將本次能力驗證的結果和分析匯報如下，希望可以供相關的檢驗、檢測實驗室和機構作參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HFsafe-1500生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；厭氧盒和厭氧產氣袋（日本三菱瓦斯化學株式會社）；KB720型生化培養箱（德國賓得）；奧林巴斯BX61顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）。ABI Veriti PCR儀（美國應用生物系統公司）

1.2 樣品 由LGC提供，西林瓶裝凍干粉。

1.3 稀釋液和培養基 稀釋液：ISO 29981-2010[1]標準中規定的稀釋液QSR液（Quarter-strength Ringer’s solution），該稀釋液主要用于乳及乳制品的微生物檢驗。QSR液的配制方法及滅菌條件：氯化鈉2.25g，氯化鉀0.105g，氯化鈣0.06g，碳酸氫鈉0.05g，溶解于1000ml水中，調節pH值于滅菌過后在6.9±0.2，滅菌條件121℃，15min。

培養基：ISO 29981-2010[1]標準中規定的TOS瓊脂培養基，使用前需添加莫匹羅星鋰鹽。該培養基中含的TOS為一種通過β-半乳糖甘酶水解乳糖得到的混合物，該混合物能夠有效的促進雙歧桿菌的生長[1][2]。食品安全國家標準GB4789.35-2010[3]中規定的改良MRS培養基，使用前添加莫匹羅星鋰鹽。培養基的配置和滅菌均按照標準中的規定進行。

附圖1 雙歧桿菌革蘭氏染色鏡檢顯微鏡圖

附表1 LGC能力驗證雙歧桿菌計數結果

附表2 雙歧桿菌計數能力驗證結果

2 方法

2.1 雙歧桿菌計數

2.1.1 稀釋液的制備 按照LGC提供的作業指導書進行操作，取QSR液10 mL加入供試品西林瓶中，充分振搖，室溫放置60min，作為10g供試品。取10g供試品，加QSR液90 mL充分振搖作為1∶10的均勻稀釋液，取1∶10稀釋液1mL，置上述緩沖液9 mL中，即為1∶102的稀釋液，以此類推，制成1∶104的稀釋液。

2.1.2 雙歧桿菌計數 分別吸取1∶104、1∶103、1∶102及1∶10稀釋液各0.1ml分別置于添加了莫匹羅星鋰鹽的改良MRS瓊脂平板或添加了莫匹羅星鋰鹽的TOS瓊脂平板上，用L形棒進行表面涂布，平行2份，同時分別取0.1ml稀釋液同法操作，作為空白對照，置37℃厭氧培養72小時，計數。以上操作分別重復3次。

2.2 雙歧桿菌的鑒定16S rDNA基因測序鑒定方法 采用快速DNA提取檢測試劑盒提取DNA，利用細菌16S rDNA通用引物27f 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’1492r：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’進行PCR擴增。反應體系： PCR MasterMix 20μl，純化水16μl，引物27f 1μl，引物1492r1μl，模板2μl。PCR擴增反應程序：94℃預變性4 min，之后的35個循環包括94℃ 預變性30 sec，55℃“退火”30sec，72℃延伸1min。35個循環后72℃延伸5min，最后4℃保存備用。擴增得到的PCR產物直接送到公司測序，測序由北京三博遠志生物技術有限責任公司完成。測序結果經NCBI數據庫比對。

3 結果與討論

3.1 雙歧桿菌的計數結果 由附表1可知，添加莫匹羅星鋰鹽的TOS瓊脂培養基的結果為2700cfu/g，略高于添加莫匹羅星鋰鹽的MRS瓊脂培養基2500cfu/g的結果。而且，同樣培養48h后觀察結果，TOS培養基培養中生長的菌落較大，而MRS培養基中生長的菌落較小，需要延長培養時間至72h。選擇添加了莫匹羅星鋰鹽的TOS瓊脂培養基的結果2700cfu/g為最終提交結果。

3.2 雙歧桿菌的鑒定結果 選取TOS培養基上的典型的單菌落，劃線于TOS培養基上，于37℃厭氧培養72h，進行革蘭氏染色、鏡檢，結果見附圖1。該菌為革蘭氏陽性桿菌，成棒狀，略彎曲。通過16SrDNA基因序列的鑒定方法，得到該菌的鑒定結果為短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）。

3.3 雙歧桿菌計數能力驗證結果的反饋 結果提交約50天后，LGC將此次能力驗證結果返回，詳細結果見表2。

Z值：由能力驗證的指定值和能力評定標準差計算的偏倚的標準化度量。Z值的計算公式為：

其中，X為添加量（理論真值），x為本實驗室結果，SDPA（Standard deviation for proficiency assessment）為能力評定標準差，該值由組織者提供。|Z|≤2為結果滿意，2＜|Z|＜3為問題結果，|Z|≥3為不滿意結果。

由附表2可知，本實驗室此次能力驗證采用添加莫匹羅星鋰鹽的TOS培養基，37℃培養的方法，結果為2700cfu/g，Z值為0.37，為滿意結果，其中LGC給出的添加量（理論真值）為2000cfu/g。

4 結論

含有雙歧桿菌的微生態調節劑作為食品或保健食品被廣泛使用，這類產品的質量與其中含有的雙歧桿菌的數量直接相關，因此，雙歧桿菌數一般認為是檢驗這類產品的指標性成分[4]。但是，雙歧桿菌的培養需要較高的營養條件和較嚴格的厭氧環境，因此，雙歧桿菌計數的檢驗能力就顯得尤為重要。

北京市藥品檢驗所（北京市保健食品化妝品檢驗中心）微生物室通過參加英國LGC組織的食品成分及微生物檢測（QSM-Quality in Microbiology PT）的第219輪第27號雙歧桿菌的計數試驗（27 Bifidobacterium），取得了滿意的結果（Z=0.37）。微生物室通過此次國際能力驗證，提高了雙歧桿菌計數的檢驗能力，再次證明了培養基、環境以及人員等各系統能夠保證出具科學有效可靠的數據，在加強能力建設的道路上又邁出了堅實的一步。