AFP mRNA檢驗對胃癌患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的預(yù)測價值

任 峰

（肥城礦業(yè)中心醫(yī)院，山東 肥城 271608）

AFP mRNA檢驗對胃癌患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的預(yù)測價值

任 峰

（肥城礦業(yè)中心醫(yī)院，山東 肥城 271608）

目的 探討胃癌患者術(shù)前外周血甲胎蛋白信使核糖核酸（AFP mRNA）檢驗對術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的預(yù)測價值。方法 選取2009年1月至2012年6月我院收治的胃癌手術(shù)患者100例，所有患者術(shù)前1 d取外周靜脈血采用反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測AFP mRNA，按照檢測結(jié)果分為AFP mRNA陰性組（n=58）和AFP mRNA陽性組（n=42）。 術(shù)后隨訪3年，觀察并對比兩組的術(shù)后1、2、3年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率。采用Kaplan-Meier法計算兩的總體生存率（OS）和無病生存率（DFS），兩組間比較Log-rank法。采用COX回歸模型分析AFP mRNA陽性是否為胃癌手術(shù)患者預(yù)后的獨立影響因素。結(jié)果 AFP mRNA陽性組術(shù)后1、2、3年腫瘤復(fù)發(fā)率分別為57.1%（24/42）、76.2%（32/42）、100.0%（42/42）；AFP mRNA陰性組分別為20.7%（12/58）、41.4%（24/58）、69.0%（40/58），AFP mRNA陽性組術(shù)后3年有14.3%（6/42）發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，AFP mRNA陰性組術(shù)后3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，AFP mRNA陽性組術(shù)后1、2、3年復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率均明顯高于AFP mRNA陰性組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；AFP mRNA陽性組術(shù)后1、2、3年OS分別為（90.1%、31.6%、10.2%）；1、2、3年DFS分別為（72.3%、22.1%、5.4%）；AFP mRNA陰性組分別為（100.0%、72.4%、25.0%）和（88.5%、52.5%、13.5%）；AFP mRNA陰性組術(shù)后1、2、3年OS和DFS均明顯高于AFP mRNA陽性組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。COX回歸分析結(jié)果顯示：AFP mRNA陽性是胃癌手術(shù)患者預(yù)后的獨立影響因素（OR=3.294，95% CI 1.895～6.423，P=0.001）。結(jié)論 術(shù)前外周血AFP mRNA陽性的胃癌患者術(shù)后更易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后相對較差。

胃癌；AFP mRNA；復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移；預(yù)后

腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響惡性腫瘤患者預(yù)后的重要因素，也是腫瘤治療上的一大難題［1］。如何降低惡性腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，是當(dāng)前腫瘤學(xué)研究的一個重要課題［2］。大量研究證實，腫瘤患者血液循環(huán)中的癌細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因［3］。AFP mRNA是檢測外周血中胃癌細(xì)胞最常用的分子標(biāo)志物［4］。本研究采用巢式RT-PCR檢測胃癌手術(shù)患者術(shù)前外周血中AFP mRNA，探討AFP mRNA陽性與胃癌患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，希望能為降低胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，改善患者的預(yù)后提供一定的幫助。

1　資料與方法

1.1研究對象：選取2009年1月至2012年6月我院收治的胃癌手術(shù)患者100例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前經(jīng)B超、CT或MRI診斷為胃癌，經(jīng)術(shù)后病理證實為胃癌；②所有患者均為根治性切除，行常規(guī)切除腫瘤，手術(shù)切緣距離腫瘤邊緣＞1 cm［5］。100例患者中男88例，女12例，年齡48～67歲，平均59.3歲；血清AFP：244～1893 μg/L；腫瘤直徑2～12 cm。按照術(shù)前AFP mRNA檢測結(jié)果分為AFP mRNA陰性組（n=58）和AFP mRNA陽性組（n=42），兩組的一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1　兩組的一般資料比較

表2　兩組生存情況比較

1.2方法

1.2.1AFP mRNA檢測方法：所有患者均于術(shù)前1 d抽取晨起肘靜脈血5 mL，采用巢式RT-PCR檢測外周血中AFP mRNA表達(dá)情況。主要步驟如下［6］：①制備有核細(xì)胞：采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法；②提取總RNA：采用異硫氰酸胍法；③cDNA合成：取2 μg RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司生產(chǎn)）合成cDNA，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行；④巢式PCR：循環(huán)條件：94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共進(jìn)行30個循環(huán)。首輪PCR擴(kuò)增為傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增，正義引物序列：5-ACACAAAAAGCCCACTCCAG-3；反義引物序列5-CTGAGCAATCATAACCGACAT-3，擴(kuò)增產(chǎn)物 457 bp；第二輪擴(kuò)增為定量 PCR 擴(kuò)增。正義引物序列: 5-GCTAGCAACGCTGAAG ATGA-3； 反義引物序列: 5-TACACAAGAATTGAGAGCGAC-3；擴(kuò)增產(chǎn)物 81 bp。AFP mRNA陽性是指 cDNA 模板在第二輪擴(kuò)增時形成典型的擴(kuò)增曲線；AFP mRNA陰性是指 cDNA 模板經(jīng)第二輪擴(kuò)增未形成典型的擴(kuò)增曲線，拷貝數(shù)為零。

1.2.2隨訪及觀察指標(biāo)：采用門診及電話回訪的方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止日期2015年6月，至少隨訪3年，記錄兩組患者術(shù)后1、2、3年內(nèi)的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及生存情況。總生存時間（OS）是指術(shù)后第1天至隨訪截止時間或死亡時間；無病生存時間（DFS）是指術(shù)后第1天至腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的時間。

1.2.3統(tǒng)計方法：采用SPSS14.0版統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用卡方檢驗，計量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較采用t檢驗。采用Kaplan-Meier法計算生存率，組間比較Logrank法，采用COX回歸模型分析AFP mRNA陽性是否為胃癌手術(shù)患者預(yù)后的獨立影響因素，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1兩組術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率比較：AFP mRNA陽性組術(shù)后1、2、3年腫瘤復(fù)發(fā)率分別為57.1%（24/42）、76.2%（32/42）、100.0%（42/42）；AFP mRNA陰性組分別為20.7%（12/58）、41.4%（24/58）、69.0%（40/58），AFP mRNA陽性組術(shù)后3年有14.3%（6/42）發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，AFP mRNA陰性組術(shù)后3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，AFP mRNA陽性組術(shù)后1、2、3年復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率均明顯高于AFP mRNA陰性組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2兩組生存情況比較：AFP mRNA陰性組術(shù)后1、2、3年OS和DFS均明顯高于AFP mRNA陽性組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。COX回歸分析結(jié)果顯示：AFP mRNA陽性是胃癌手術(shù)患者預(yù)后的獨立影響因素（OR=3.294，95%CI 1.895～6.423，P=0.001）。

3　討 論

胃癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，預(yù)后差。目前，手術(shù)切除仍是根治胃癌的主要方法，但其手術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高［7］。因此，尋找能反應(yīng)血液循環(huán)中胃癌細(xì)胞的分子標(biāo)志物，對預(yù)測胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，及時采取適當(dāng)措施進(jìn)行預(yù)防，具有重要的臨床意義，也是目前胃癌研究的重點課題。胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制有以下幾種：①播散入血液循環(huán)中的胃癌細(xì)胞重新定植于肝臟或其他組織器官［8］；②胃癌多中心性發(fā)生［9］；③胃癌細(xì)胞通過肝內(nèi)門靜脈轉(zhuǎn)移至腫瘤外肝組織，在術(shù)前已經(jīng)侵及切除范圍以外的組織［10］。研究發(fā)現(xiàn)胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生取決于胃癌細(xì)胞對轉(zhuǎn)移組織的選擇性及機(jī)體的反應(yīng)性［11］。胃癌細(xì)胞自原發(fā)部位脫落經(jīng)門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)，首先一部分胃癌細(xì)胞被機(jī)體免疫細(xì)胞攻擊或為機(jī)械力所破壞，剩余的胃癌細(xì)胞被小血管捕獲后移出血管，形成復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶［12］。

本研究采用RT-PCR法測定AFP mRNA作為胃癌患者血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物，其理論基礎(chǔ)為：①甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）是肝癌細(xì)胞表達(dá)的高特異性蛋白質(zhì)，70%～80%的胃癌患者在發(fā)病期間都有AFP基因高表達(dá)的特征，AFP基因在胎兒發(fā)育過程開放并表達(dá)，但在出生2年后基本處于關(guān)閉狀態(tài)，肝癌發(fā)生時AFP的基因重新被激活而大量表達(dá)，在臨床上被認(rèn)為是胃癌的經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物，因而被當(dāng)作診斷肝癌的金標(biāo)準(zhǔn)［13］，胃與肝臟同屬于消化系統(tǒng)，多位學(xué)者均經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)AFP對胃癌的診斷價值較大；②AFP mRNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)是翻譯合成AFP的物質(zhì)基礎(chǔ)，在正常胃細(xì)胞內(nèi)表達(dá)微弱，在癌細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)烈；另外，外周血中有大量的RNA酶，游離于外周血中的AFP mRNA易被降解；因此如果在外周血中檢測到AFP mRNA就說明外周血中存在尚具有活性的胃癌細(xì)胞［14］；③RT-PCR技術(shù)是非常敏感，能在100萬～1000萬個正常的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一個腫瘤細(xì)胞，使早期發(fā)現(xiàn)胃癌患者血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞成為可能［15］。

本研究隨訪，觀察術(shù)前外周血中AFP mRNA陽性患者與AFP mRNA陰性患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及生存情況，結(jié)果顯示：術(shù)前外周血中AFP mRNA陽性患者術(shù)后1、2、3年的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率明顯高于AFP mRNA陰性患者，術(shù)前外周血中AFP mRNA陰性患者術(shù)后1、2、3年的總體生存率和無病生存率均明顯高于AFP mRNA陽性患者；AFP mRNA陽性是影響胃癌手術(shù)患者的獨立影響因素，說明術(shù)前外周血中AFP mRNA陽性患者術(shù)后容易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，從而影響了患者生存期，提示我們在對于術(shù)前外周血檢測AFP mRNA陽性的患者，術(shù)前應(yīng)積極進(jìn)行抗腫瘤治療，監(jiān)測外周血AFP mRNA的表達(dá)，術(shù)后繼續(xù)給予抗腫瘤治療以降低術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，改善患者預(yù)后。Adachi等［16］報道外周血AFP mRNA陽性的胃癌患者經(jīng)過治療后，其血液AFP mRNA轉(zhuǎn)為陰性。

綜上所述，外周血AFP mRNA陽性是胃癌細(xì)胞存在于血液循環(huán)中的直接證據(jù)，也是胃癌患者術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源。術(shù)前檢測外周血AFP mRNA表達(dá)，對預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有重要的臨床意義。何如有效的將外周血中的AFP mRNA陽性轉(zhuǎn)為陰性即消除血液循環(huán)中胃癌細(xì)胞是目前胃癌研究的重要課題。

［1］ 王國芳，徐美珍，張歡妍，等.甲胎蛋白異質(zhì)體和甲胎蛋白聯(lián)合檢測的臨床價值［J］.淮海醫(yī)藥，2015，33（1）:20-22.

［2］ 田藍(lán)天，姚珂，吳傲，等.例產(chǎn)甲胎蛋白胃癌回顧性分析［J］.中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2011，14（6）:441-443.

［3］ 胡萬寧，韓素桂，趙洪煥，等.產(chǎn)甲胎蛋白的胃癌患者血清甲胎蛋白異質(zhì)體檢測分析［J］.標(biāo)記免疫分析與臨床，2013，20（5）:366-367.

［4］ 王宏波，張軍，丁光輝，等.甲胎蛋白與胃癌［J］.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2008，15（7）:541-542.

［5］ Kochi M，F(xiàn)ujii M，Kaiga T，et al.FLEP chemotherapy for al-phafetoprotein-producing gastric cancer［J］.Oncology，2014，66（6）:445.

［6］ Shimada S，Hayashi N，Marutsuka T，et al.Irinotecan plus low-dose cisplatin for alpha-fetoprotein-producing gastric carci-noma with multiple stomach metastases: report of two casess［J］.Surg Today，2012，32（12）:1075.

［7］ Kamei S，Kono K，Amemiya H，et al.Evaluation of VEGF and VEGF-C expression in gastric cancer cells producing alpha-fetoprotein［J］.J Gastroenterol，2003，38（6）:540.

［8］ Zhang Z，Yamashita H，Toyama T，et al.ATBF1 A mes-senger RNA expression is correlated with better prognosis in breast cancer［J］. Clin Cancer Res，2005，11（1）:193.

［9］ Fujii H，Ichikawa K，Takagaki T，et al.Genetic evolution of alpha fetoprotein producing gastric cancer［J］.J Clin Pathol，2003，56（12）: 942.

［10］ Kataoka H，Miura Y，Joh T，et al.Alpha-fetoprotein produ-cing gastric cancer lacks transcription factor ATBF1［J］.Oncogene，2001，20（7）: 869.

［11］ 宋霞，陳濤，王一萍，等.AFP、CEA聯(lián)合檢測對消化道惡性腫瘤早期診斷價值［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，36（1）:118-119.

［12］ 方瑜，王琳，李桂梅，等.VEGF在AFP陽性胃癌中的表達(dá)及意義［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，50（3）:357-359.

［13］ 高柳艷，湯建林，唐秀萍.CEA、AFP、CA50、CA19-9和CA72-4聯(lián)合檢測在消化道惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用價值［J］.中外醫(yī)學(xué)研究，2015，13（10）:71-73.

［14］ Kono K，Amemiya H，Sekikawa T，et al.Clinicopathologic features of gastric cancers producing alpha-fetoprotein［J］.Dig Surg，2002，19（5）:359.

［15］ Koide N，Nishio A，Igarashi J，et al.Alpha-fetoprotein producing gastric cancer: histochemical analysis of cell proliferation，apoptosis，and angiogenesis［J］.Am J Gastroenterol，1999，94（6）:1658.

［16］ Adachi Y，Tsuchihashi J，Shiraishi N，et al.AFP-producing gastric carcinoma:multivariate analysis of prognostic factors in 270 patients［J］.Oncology，2003，65（2）:95.

The Relationship of the AFP mRNA Positive with the Tumor Recurrence and Metastasis and Prognosis in Patients with Stomach Cancer Postoperatively

REN Feng
（Feicheng Mining Center Hospital， Feicheng 271608， China）

Objective To study the relationship of the AFP mRNA positive with the tumor recurrence and metastasis and prognosis in patients with stomach cancer postoperatively. Method Selected 100 patients with hepatocellular carcinoma who received surgery from January 2009 to June 2012， test the AFP mRNA of the peripheral venous blood by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） 1d before the surgery， divided into AFP mRNA negative groups （n = 59） and AFP mRNA positive group （n = 42）， according to the test results. Postoperative follow-up of 3 years， observed and compared the recurrence and transfer rate of postoperative 1， 2， 3 years of the two groups. Using the Kaplan-Meier method to calculate the overall survival （OS）rate and disease-free survival （DFS） rate， tested by the Log - rank method. Using the COX regression model to analysis the AFP mRNA positive whether the independent influence factors of the prognosis of patient received surgery. Results The tumor recurrence rate of the AFP mRNA positive group 1， 2，3 years after the surgery respectively was 57.1% （24/42）， 76.2% （32/42）， 100.0% （42/42）； AFP mRNA negative group respectively was 20.7% （12/58），41.4% （24/58）， 69.0% （40/58）， 3 patients 14.3% （6/42） happened a pulmonary metastasis years in AFP mRNA positive group in 3 years， there was no distant metastasis in AFP mRNA negative groups in 3 years， the metastasis and recurrence rate of the AFP mRNA positive group 1， 2， 3 years after surgery were significantly higher than that of AFP mRNA negative groups， had statistically significant difference （P＜0.05）； 1， 2， 3 years OS rate of the AFP mRNA positive groups respectively was （90.1%， 31.6%， 10.2%）；1， 2， 3 years DFS rate respectively was （72.3%， 22.1%， 5.4%）； AFP mRNA negative group respectively was（100.0%， 72.4%， 25.0%）， and （88.5%， 52.5%， 13.5%）； the 1， 2， 3 years DFS and OS of the AFP mRNA negative groups were significantly higher than that of AFP mRNA positive， had statistically significant difference （P＜0.05）. The results of the COX regression analysis showed that the AFP mRNA positive was independent influence factors of the prognosis of patient received surgery （OR = 3.294， 95% CI 3.294 to 6.423， P= 0.001）. Conclusion Stomach cancer patients with AFP mRNA positive of peripheral blood preoperative more easyer to recurrence and metastasis， had a relatively poor prognosis.

Stomach cancer； AFP mRNA； Recurrence； Metastasis； The prognosis

R735.2

B

1671-8194（2015）24-0015-03