杏鮑菇多糖的單糖組成分析及其抗氧化活性研究

羅懿洋，任道遠，陳麗芳，楊興斌

（教育部藥用資源與天然藥物化學重點實驗室陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710119）

杏鮑菇多糖的單糖組成分析及其抗氧化活性研究

羅懿洋，任道遠，陳麗芳，楊興斌*

（教育部藥用資源與天然藥物化學重點實驗室陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710119）

采用水提醇沉法提取杏鮑菇多糖，通過苯酚-硫酸法測定多糖總含量，利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化高效液相色譜（HPLC）分析單糖組成。在體外抗氧化評價體系研究杏鮑菇多糖的總還原力及對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除活性。其多糖的總糖含量達62.9%，分別由D-甘露糖、D-核糖、D-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-巖藻糖組成，其相對摩爾百分比分別為9.8%、1.6%、0.15%、0.8%、62.8%、0.05%、24.4%、0.4%。結果表明，杏鮑菇多糖是一種典型的雜多糖，具有較強的抗氧化活性。

杏鮑菇，多糖，單糖組成，HPLC，抗氧化

杏鮑菇（Pleurotus eryngii），隸屬于真菌門，擔子菌亞門，真擔子菌綱，傘形目，側耳科，側耳屬，它是歐洲南部、非洲北部以及中亞地區高山、草地、沙漠地帶的一種品質優良的大型肉質菌［1］。杏鮑菇具有菌肉肥厚、質地脆嫩、口感極佳的特點，其口味兼具杏仁香味和鮑魚風味，非常適合食用［2］。現代藥理學研究表明，杏鮑菇中所含的真菌多糖能增強肌體免疫功能，具有抗病毒，降低機體膽固醇，防止動脈硬等功能［3］。據文獻資料介紹杏鮑菇子實體入藥有降血壓、血脂之功效，其多糖含量豐富，與雙歧桿菌結合有改善腸胃功能和美容效果，多糖還具有抗癌效果。多項研究表明，過多的自由基會直接損害核酸、蛋白質、脂類，導致各種炎癥、變態性疾病、癌癥、衰老等一系列病變發生［4］。因此，多糖在生命科學領域的研究具有極高的推廣開發價值。多糖化合物廣泛存在于植物當中，具有多種保健功能，是當今功能性食品的研究熱點。目前有關杏鮑菇的栽培已有報道，但是對杏鮑菇多糖的報道甚少，基于上述原因，本文分離提取杏鮑菇多糖并對其單糖組成和抗氧化活性進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏鮑菇 當地超市；無水乙醇、濃硫酸、苯酚、KH2PO4天津市天力化學試劑有限公司；葡萄糖、鐵氰化鉀、FeSO4、三氯乙酸（TCA）、FeCl3天津市富晨化學試劑廠；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、氯化硝基四氮唑藍（NBT）、甲基吩嗪甲基硫酸鹽（PMS） Wako公司；D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和D-巖藻糖 美國Sigma公司；三氟乙酸（TFA）、三乙胺（TEA） 德國Merck公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 北京化學試劑公司；色譜甲醇和乙腈 美國Honeywell公司；水楊酸 天津市登封化學試劑廠；H2O2天津市東麗區天天化學試劑廠；實驗用水 為蒸餾水和超純水。

752N紫外可見分光光度計 上海精科；RE-2000A旋轉蒸發器、SHB－Ⅲ循環水多用真空泵 上海比朗儀器有限公司；LD4-2低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；KQ-300DE型數控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；EZ-DRY冷凍干燥設備、HH-6B數顯恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司；SL202N型藥物電子天平 上海明橋精密科學儀器有限公司；透析袋 華美生物工程公司；FZ102微型植物粉碎機 黃驊市中興有限責任公司；超純水儀 M ILLI-Q M ILLIPORE公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏鮑菇多糖的提取 參考何念武［5］水提醇沉方法提取出杏鮑菇多糖并進行冷凍干燥。

1.2.2 糖含量的測定 苯酚-硫酸法［6］測定多糖總含量。多糖在濃硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定其吸光值，以標準葡萄糖濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標制作出標準曲線，將樣品吸光值帶入回歸方程得到杏鮑菇粗多糖中的單糖濃度，即可得到該多糖的糖含量。

1.2.3 HPLC分析杏鮑菇多糖的單糖組成［7-9］參照本實驗室已經建立的高效液相色譜分析方法［10］。流動相A為純乙腈；B由0.45g KH2PO4、0.5m L TEA、100m L乙腈和900m L超純水組成（pH 7.5）。色譜柱：Venusil C18柱（250mm×4.6mm ID，5μm）；梯度洗脫：0min，94%B；4m in，94%B；5m in，88%B；30m in，88%B。進樣量10μL，流速1.0m L·m in-1，檢測波長為250nm，柱溫為35℃。

1.2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取一定量的10種單糖，分別用10%甲醇溶液配制成0.1mol·L-1的母液。取適量母液稀釋為5個不同濃度的系列單糖溶液，參考Honda等［9］衍生化方法并作適當的改進：取單糖混合溶液100μL，依次加入0.5mol·L-1PMP甲醇溶液200μL和0.3mol·L-1NaOH溶液300L。混勻后在70℃水浴反應60min，冷卻至室溫，用0.3mol·L-1HCl溶液300μL中和。加入氯仿1.0m L，振蕩、離心，重復萃取3次。取上層水相加蒸餾水稀釋至適當濃度0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液備用。

1.2.3.2 供試品溶液的制備 取杏鮑菇多糖20mg，加入2m L摩爾濃度為3mol·L-1的TFA，于安培瓶中混合，并用氮氣封口于95℃酸解8h，之后1000r/min離心5m in，上清液轉入5m L的圓底燒瓶中解壓蒸干，再加入1m L超純水溶解，得到酸解好的多糖樣品。再取酸解好的樣品100μL，按照1.2.3.1項下方法制備PMP標記物，得到樣品的PMP標記物。

1.2.4 杏鮑菇多糖體外抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力測定 參照何念武［5］、TIAN［11］、呂喜茹［12］的方法稍作修改，參照盛偉［13］設置樣品濃度范圍，評價杏鮑菇多糖對DPPH自由基的清除能力。將3.0m L DPPH（1mmol）溶液與1.0m L不同濃度的樣品溶液分別加入試管中，充分混合，黑暗處理30m in，517nm處測定吸光值。VC作陽性對照，用蒸餾水代替多糖溶液做陰性對照，用甲醇代替DPPH做本底組對照。清除率按以下公式計算：

清除率（%）=［1-（Aa-Ab）/A0］×100

其中，Aa為樣品吸光值，Ab為樣品本底吸光值，A0為陰性對照值。

1.2.4.2 羥基自由基的清除能力測定 參照何念武［5］、TIAN［11］、呂喜茹［12］的方法稍作修改，參照盛偉［13］的方法設置樣品濃度，評價杏鮑菇多糖對羥基自由基的清除能力。向10m L離心管中依次加入1m L多糖溶液，1m L FeSO4溶液，1m L水楊酸-乙醇溶液和1m L H2O2溶液，于37℃水浴1h，然后在510nm處測定吸光值。用蒸餾水代替多糖溶液做陰性對照，用蒸餾水代替H2O2溶液做本底對照。清除率的計算：

清除率（%）=［1-（Aa-Ab）/A0］×100

其中，Aa為樣品吸光值，Ab為樣品本底吸光值，A0為陰性對照值。

1.2.4.3 超氧陰離子的清除能力測定 參照何念武［5］、TIAN［11］、呂喜茹［12］的方法稍作修改，參照盛偉［13］的方法設置樣品濃度，測定杏鮑菇多糖對超氧陰離子的清除能力。向試管中依次加入1m L NBT溶液，1m L NADH溶液，1m L不同濃度的多糖溶液，0.4m L PMS溶液，充分混勻，靜置5m in，在560nm處測其吸光值。用蒸餾水代替多糖溶液做陰性對照，蒸餾水代替PMS做本底組對照，VC做陽性對照。清除率計算：

清除率（%）=［1-（Aa-Ab）/A0］×100

其中，Aa為樣品吸光值，Ab為樣品本底吸光值，A0為陰性對照值。

1.2.4.4 總還原能力測定 參照Oyaizu［14］提供的方法對杏鮑菇多糖的總還原能力做評價。取1m L多糖溶液，加入2.5m L磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH 6.6），2.5m L鐵氰化鉀溶液（1%），充分混合，50℃水浴20min，然后加入2.5m L的TCA（10%W/V）混勻，3000r/m in離心10m in，取上清液2.0m L，放入另一支試管中，依次加入2.0m L蒸餾水和0.5m L FeCl3（0.1%），混勻，室溫靜置10m in，然后于700nm處測定吸光值。VC做陽性對照，用蒸餾水代替0.1%FeCl3溶液做本底對照。

2 結果與分析

2.1 杏鮑菇多糖的總糖含量測定

以標準葡萄糖濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪得標準曲線，求得回歸方程為y=10.18x+0.1084（R2=0.9928）。同時測得杏鮑菇粗多糖濃度0.08mg·m L-1時的吸光度為0.621，代入回歸方程中計算出杏鮑菇粗多糖中所含單糖的濃度為0.05mg·m L-1，得到杏鮑菇多糖的總糖含量為62.9%。

2.2 HPLC分析杏鮑菇多糖的單糖組成

從標準品的高效液相色譜圖1（B）中清晰的看出10種標準單糖的色譜峰。從樣品的高效液相色譜圖1（A）中能清晰的看出，杏鮑菇多糖樣品中各組成單糖能夠保持很好的基線分離其中1、2、3、4、6、7、8、10號位置的8種單糖含量較多。結果表明，杏鮑菇多糖是一種酸性雜多糖，單糖組成分別為D-甘露糖、D-核糖、D-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-巖藻糖，所有定量的單糖相對摩爾百分比分別為9.8%、1.6%、0.15%、0.8%、62.8%、0.05%、24.4%、0.4%。

圖1 樣品（A）與標準品（B）高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatography of sample（A）and standards（B）

圖2 杏鮑菇多糖與VC對DPPH的清除作用Fig.2 Concentration-dependent scavenging activity of Pleurotus eryngii polysaccharides against DPPH free radicals

表1 杏鮑菇多糖的組成測定結果Table 1 Analytical results of component monosaccharides of polysaccharides from Pleurotus eryngii

由標準品（5～25μL）的5個不同進樣量經PMP標記和HPLC分析，獲得各PMP標記單糖的峰面積。以標準品的峰面積（Y）為縱坐標，以各單糖物質的量（μmol）為橫坐標，繪制標準曲線，得到10條回歸曲線。將杏鮑菇多糖樣品得到的10個峰面積帶入相應的單糖回歸曲線中即可計算出該單糖的物質的量和百分比。

2.3 杏鮑菇多糖體外抗氧化活性研究

2.3.1 對DPPH自由基的清除功效 DPPH在溶液中生成一個穩定的含氮自由基且該溶液呈典型的紫色，在紫外-可見（UV-Vis）光區具有較強的吸收光譜。當DPPH溶液中加入抗氧化劑時，由于其自由基清除作用使DPPH紫色消退導致吸收光譜強度隨加入的抗氧化劑的量的增加而減小，通過加入抗氧化劑前后吸光度的變化計算自由基清除率［15］。由圖2可知，VC對DPPH自由基的清除能力很強，當VC濃度為0.5mg·m L-1時，清除率即可達到91.04%。樣品濃度在0.25～2.5mg·m L-1范圍內，隨著樣品濃度的上升，杏鮑菇多糖對DPPH自由基的清除能力逐漸增強。當樣品濃度為2.5mg·m L-1時，清除率為73%。對比何念武［5］的實驗，清除率的變化具有相同的趨勢，均隨樣品濃度升高而升高。結果顯示，杏鮑菇多糖對DPPH自由基有一定的清除能力。

2.3.2 對羥基自由基的清除功效 Fenton反應［16］中FeSO4與H2O2反應產生·OH。·OH具有較高的反應活性，存活時間短。水楊酸能夠有效捕捉·OH并產生有色物質，該物質在510nm處有強吸收峰。在反應體系中加入具有能清除·OH的物質，可以減少有色物質的生成。故可以通過在510nm處測定吸光值的變化來測定該物質清除羥自由基的能力，從而判斷其抗氧化能力。由圖3可知，VC對羥基自由基的清除能力很強，當VC濃度為0.5mg·m L-1時，清除率即可達到88.87%，清除能力幾近飽和狀態。杏鮑菇多糖對羥基自由基同樣有一定的清除能力，樣品濃度在0.25～2.0mg·m L-1范圍內，隨著濃度的上升，杏鮑菇多糖對羥基自由基的清除能力逐漸增強。當樣品濃度為2.5mg·m L-1時，清除率為75%。對比何念武［5］的實驗，清除率的變化具有相同的趨勢，均隨樣品濃度升高而升高。對比盛偉［13］的實驗，同等樣品濃度下清除率略高于盛偉的結果。結果顯示，杏鮑菇多糖對羥自由基有一定的清除能力。

圖3 杏鮑菇多糖與VC對羥基自由基的清除作用Fig.3 Concentration-dependent scavenging activity of Pleurotus eryngii polysaccharides against hydroxyl free radicals

2.3.3 對超氧陰離子（O2·-）自由基的清除功效 在NADH-PMS-NBT體系中，NADH與NBT反應產生超氧陰離子，超氧陰離子與PMS結合生成的化合物顯色并在560nm處具有最大吸光值。由圖4可知，VC對超氧陰離子自由基的清除能力很強，當VC濃度為0.5mg·m L-1時，清除率即可達到88.65%，而杏鮑菇多糖對超氧陰離子自由基同樣有一定的清除能力，樣品濃度在0.25～2.0mg·m L-1范圍內，隨著濃度的上升，對超氧陰離子自由基的清除能力逐漸增強。當樣品濃度為2.5mg·m L-1時，清除率為75%。對比何念武［5］的實驗，清除率的變化具有相同的趨勢，均隨樣品濃度升高而升高。對比盛偉［13］的實驗，同等樣品濃度下清除率略高于盛偉的結果。結果顯示，杏鮑菇多糖對羥自由基有一定的清除能力。

圖4 杏鮑菇多糖與VC對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.4 Concentration-dependent scavenging activity of Pleurotus eryngii polysaccharides against superoxide anionfree radical

2.3.4 總還原能力的測定 抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子來清除自由基，還原力越大則抗氧化性越強。由此可根據還原力的大小來判斷其抗氧化活性的大小。其反應生成物在700nm處的吸光度的大小即反映了抗氧化能力的大小，吸光度值越大則樣品的還原能力越強［17］。由圖5知，樣品濃度在0.25～2.0mg·m L-1范圍內，杏鮑菇多糖還原力測試混合液的吸光度隨著質量濃度的增加而增大，當質量濃度為2.5mg·m L-1時，測試混合液的吸光度為0.633，對比何念武［5］的實驗，清除率的變化具有相同的趨勢，均隨樣品濃度升高而升高。對比盛偉［13］的實驗，同等樣品濃度下吸光度基本一致。結果顯示，杏鮑菇多糖具有良好的還原能力。

圖5 杏鮑菇多糖總還原能力Fig.5 Reducing power of Pleurotus eryngii polysaccharides

3 結論

采用水提醇沉法提取杏鮑菇粗多糖，測得其多糖的總糖含量達62.9%。利用柱前衍生化高效液相色譜法測得杏鮑菇多糖由D-甘露糖、D-核糖、D-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-巖藻糖組成，其相對摩爾百分比分別為9.8%、1.6%、0.15%、0.8%、62.8%、0.05%、24.4%、0.4%。在體外抗氧化研究中表明杏鮑菇多糖具有良好的還原能力及對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子的清除能力。說明杏鮑菇多糖具有良好的抗氧化活性，能夠作為一種天然的抗氧化劑。

［1］姚自奇，蘭進.杏鮑菇研究進展［J］.食用菌學報，2004，11（1）：52-58.

［2］王鳳芳.杏鮑菇中營養成分的分析測定［J］.食品科學，2002，23（4）：132-135.

［3］潘崇環，孫萍.珍稀食用菌栽培與名貴野生菌的開發利用［M］.北京：中國農業出版社，2004：93.

［4］楊立紅，史亞麗，王曉潔，等.杏鮑菇多糖的分離純化及生物活性的研究［J］.食品科技，2005（6）：18-21.

［5］何念武，楊興斌，田靈敏，等.黃瓜多糖的體外抗氧化活性［J］.食品科學，2011，32（19）：70-74.

［6］楊梅，王麗雅，莊躍飛，等.杏鮑菇多糖的提取及其分離的研究［J］.中國食用菌，2006，24（4）：38-39.

［7］Tian L M，Zhao Y，Guo C，et al.Yang.A comparative study on the antioxidant activities of an acidic polysaccharide and various solvent extracts derived from herbal Houttuynia cordata［J］.Carbohydrate Polymers，2011（83）：537-544.

［8］Lv Y，Yang X B，Zhao Y，et al.Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum by HPLC with indirect UV detection［J］.Food Chemistry，2009，112：742-746.

［9］SHonda，E Akao，SSuzuki，et al.Highperformance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly ultraviolet absorbing and electro-chemically sensitive 1-phenyl-3-methyl-5-phrazolone derivatives［J］.Analytical Biochemistry，1989，180：351-357.

［10］田靈敏，邱雪梅，潘子敬，等.新型糖組成高效液相色譜分析技術的構建及其在水飛薊多糖質控中的應用［J］.藥學學報，2010，45（4）：498-504.

［11］Tian LM，Zhao Y，Guo C，et al.A comparative study on the antioxidant activities of an acidic polysaccharide and various solvent extracts derived from herbal Houttuynia cordata［J］. Carbohydrate Polymers，2011，83：537-544.

［12］呂喜茹，郭亮，常明昌，等.姬松茸多糖抗氧化作用［J］.食用菌學報，2010，17（1）：69-71.

［13］盛偉，方曉陽，吳萍，等.白靈菇、杏鮑菇、阿魏菇多糖體外抗氧化活性研究［J］.食品工業科技，2008，5：103-109.

［14］M Oyaizu.Studies on products of browning reactions：antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine［J］.Japanese Journal of Nutrition，1986，44：307-315.

［15］李鉉軍，崔勝云.抗壞血酸清除DPPH自由基的作用機理［J］.食品科學，2011，32（1）：86-87.

［16］Song H，Zhang Q，Zhang Z，et al.In vitro antioxidant activity of polysaccharides extracted from Bryopsis plumose［J］. Carbohydrate Polymers，2010，80：1057-1061.

［17］張虹.杏鮑菇菌糠粗多糖的抗氧化活性檢測及分離純化［D］.洛陽：河南科技大學，2012：14-15.

Study on analysis and antioxidant activity in vitro of the monosaccharide composition of Pleurotus eryngii

LUO Yi-yang，REN Dao-yuan，CHEN Li-fang，YANG Xing-bin*
（Key Laboratory for Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry，College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710119，China）

The polysaccharide was obtained with the water extraction and alcohol precipitation method. The totalcarbohydrate content and monosaccharide composition were measured by phenol-sulfuric acid method and1 - phenyl - 3 - methyl - 5 - pyrazolone pre -column derivatization high performance liquid chromatography（HPLC） method，resepectively. Moreover，the total reducing power and reducing power of Pleurotus eryngiipolysaccharides on DPPH and hydroxyl radicals and superoxide anion free radical in vitro was measured . Thetotal carbohydrate content of Pleurotus eryngii polysaccharide was 62.9％，which was composed of D-mannose，D-ribose，D-rhamnose，D-glucose，D-glucuronic acid，D-xylose，D-galactose and D-fucose with a relativemolar percentage of 9.8％，1.6％，0.15％，0.8％，62.8％，0.05％，24.4％，0.4％. The results showed that:Pleurotuseryngii polysaccharide was a typical heteropolysaccharide and had strong antioxidant activity.

Pleurotus eryngii；polysaccharide；monosaccharide composition；HPLC；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）08-0158-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.023

2014－07－02

羅懿洋（1991-），女，碩士研究生，主要從事食品營養與功能方面的研究。

*通訊作者：楊興斌（1969-），男，博士，教授，主要從事食品生物技術、食品分子營養與功能性食品方面的研究。

國家自然科學基金項目（C31171678）。