免疫磁分離技術在食源性單增李斯特菌檢測中應用的研究進展

毛 燕，黃小林，許恒毅，熊勇華

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047）

免疫磁分離技術在食源性單增李斯特菌檢測中應用的研究進展

毛 燕，黃小林，許恒毅，熊勇華*

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047）

食源性單增李斯特菌是李斯特菌屬中的唯一能引起人類疾病的病原菌，致死率30%～70%，并嚴重威脅著人類健康。早期快速準確地檢測出食品中可能污染的單增李斯特菌對于減少死亡率非常重要，因此亟需建立一些快速、靈敏和高特異性的檢測方法。現有單增李斯特菌的檢測方法對未經前增菌的食品樣本檢測靈敏度較低，限制了這些方法直接用于食品樣本中單增李斯特菌的快速檢測。免疫磁分離是一種可以短時間內高效富集樣本中目的菌的技術，與常用的檢測方法結合，可以縮短檢測周期，提高檢測靈敏度。本文綜述了免疫磁分離技術在食源性單核細胞增生性李斯特檢測中應用的研究進展。

單增李斯特菌，免疫磁分離技術，檢測

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是兼性厭氧的革蘭氏陽性短桿菌，是李斯特菌屬中唯一一種能引起人類和動物疾病的病原菌，感染后臨床表現為腦膜炎、敗血癥、胃腸炎和流產等，死亡率較高［1-2］。1981年，加拿大首次報道了L.monocytogenes引起的食物中毒事件，隨后在歐美其他國家也相繼出現對此類事件的報道［3］。2011年美國有147人因食用了被L.monocytogenes污染的甜瓜而染病，其中33人死亡，1人流產［4］。因此，早期快速檢測出食品中可能污染的L.monocytogenes對于預防由L.monocytogenes引起的食物中毒尤為重要。目前用于L.monocytogenes的檢測方法主要包括基于前增菌、選擇性平板分離以及生理生化鑒定的傳統檢測方法及基于免疫學和分子生物學的檢測方法。然而，上述檢測方法都需要對目的菌進行預增菌，以達到檢測方法所需的最低檢測濃度。但預增菌過程耗時較長，難以實現早期快速檢測。近幾年免疫磁分離技術（Immunomagnetic separation，IMS）被廣泛應用于食源性致病菌的富集和分離。該技術可以對目的菌進行特異性捕獲并在磁場下進行分離，從而達到較高的富集效率，縮短預增菌時間。此外，可以將目的菌從復雜的食品基質中分離出來，有效地消除了食品基質對后續檢測的干擾。本文綜述了免疫磁分離技術在食源性單增李斯特菌檢測中應用的研究進展。

1 免疫磁分離技術（IMS）

免疫磁分離技術是70年代中期發展起來的一項免疫學技術，已被廣泛應用于蛋白純化、微生物富集和細胞純化等方面。其原理是通過抗體（或抗原）包被磁珠，與目標抗原（或抗體）發生特異性免疫學反應，在外加磁場作用下將目標物從復雜的樣本基質中分離出來。因此，免疫磁分離技術既具備了固相化試劑特有的優點（如較好的穩定性），又具備了免疫學反應的高度專一性。相對于傳統細菌分離方法，免疫磁分離技術是一種利用抗體偶聯于磁性粒子表面快速高效且特異性濃縮目的菌的新方法。使用該技術可以濃縮目的菌以達到檢測方法的最低濃度，從而使目的菌不經預增菌被快速檢出，最大程度降低致病菌污染引起的危害。目前，該技術與相關后續檢測方法結合被廣泛用于L.monocytogenes的檢測，見圖1。表1詳細比較了結合IMS的檢測方法在食源性致病菌檢測中應用的優缺點。

圖1 IMS與其它技術結合用于檢測單增李斯特菌Fig.1 IMS combined with other techniques for detecting Listeria monocytogenes

2 結合IMS的檢測技術用于檢測單增李斯特菌

2.1 IMS-顯色培養基

顯色培養基是利用微生物自身代謝產生的酶與相應顯色底物反應顯色的原理來檢測微生物的新型培養基，利用顯色培養基進行微生物的篩選分離，其反應的靈敏度和特異性遠優于傳統培養基。Wadud等［23］通過IMS結合ALOA顯色培養基檢測方便食品中污染的L.monocytogenes。檢測時間為4d，最低檢測限為1CFU/25g。同時Wen等［24］將IMS與顯色培養基進行結合，對牛奶樣本中的L.monocytogenes進行檢測，檢測時間30h，最低檢測限達到0.7CFU/m L。兩種方法結合檢測時間較長，但檢測靈敏度高。

2.2 IMS與PCR技術的結合

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種可在體外快速擴增特定基因或DNA序列的技術，可短時間內獲得數百萬個特異DNA序列拷貝。該方法簡單快速、靈敏度高、實用性強并能實現自動化，在基因工程研究、分子生物學研究以及對遺傳病、惡性腫瘤和傳染病的研究中得到廣泛應用。近年來，隨著IMS技術的逐漸成熟，其結合PCR技術也受到了廣泛的關注。IMS結合PCR技術巧妙地將二者的優點結合在一起。即PCR方法良好的特異性與免疫磁珠良好的敏感性互相彌補，可提高PCR方法的靈敏度和特異性；此外，IMS通過抗體（或抗原）包被的免疫磁珠特異性地結合目標抗原或抗體，在外加磁場的作用下，將目標物從復雜的食品基質中分離出來，可有效地去除反應體系中對PCR具有抑制作用的抑制因子。IMS還可以起到濃縮目標物，縮短檢測周期的作用。

2.2.1 IMS-PCR 一般PCR僅應用一對引物，通過PCR擴增產生一個核酸片段，可用于單一致病因子的鑒定。Hudson等［25］使用IMS分離火腿樣本中污染的L.monocytogenes，結合常規PCR檢測，結果發現，每1g樣本中可檢測出1.1個細菌，檢測時間僅需24h。Wang等［26］通過IMS富集蘋果汁中的A licyclobacillus acidoterrestris，結合常規PCR檢測，得到最低檢測限為2×101CFU/m L，且檢測時間為3～4h。Moreira等［27］使用IMS-PCR技術分離檢測豬肉和雞肉樣本中污染的S.typhimurium，結果發現，最低檢測限為1～10CFU/25g，檢測時間為27h。

2.2.2 IMS-RT-PCR 實時熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實時監測整個PCR反應進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析，具有操作簡便、快速高效、高通量及高敏感性等特點。此外，RT-PCR檢測的是熒光信號的改變，省去凝膠電泳程序，避免實驗過程中接觸致癌物質，且縮短檢測周期。IMS結合RT-PCR可用于L.monocytogenes定性及定量檢測，其檢測靈敏度較高。Yang等［28］將IMS與實時PCR技術結合用于檢測牛奶樣本中的L.monocytogenes，結果發現，檢測靈敏度達102CFU/0.5m L。該研究還發現在103～107CFU/0.5m L范圍內，由IMS結合實時PCR檢測所得的菌落數比平板計數所得的菌落數高出1.5～7倍，表明通過IMS與實時PCR結合可提高樣品中L.monocytogenes的檢測靈敏度。同時這兩種方法的結合在其他細菌的檢測中也有應用。Ha等［29］通過IMS結合實時PCR檢測植物和土壤樣本中的Ralstonia solanacearum R3Bv2，結果發現，其最低檢測限低于500個細菌/m L，且檢測時間縮短到幾小時。Li等［30］使用IMS結合實時PCR檢測六種食品樣本中Salmonella spp.，結果發現，有3h前增菌過程的檢測限為0.6CFU/m L，而無前增菌過程的最低檢測限也達到了60CFU/m L。

2.2.3 IMS-mPCR 多重PCR（multiplex PCR，mPCR），又稱多重引物PCR或復合PCR，是在同一PCR反應體系里加上兩對或兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理、操作過程和反應試劑與常規PCR相同。多重PCR可用于多種致病菌的同時檢測或鑒定，即在同一PCR反應管中同時加上多對特異性引物，進行擴增，可特異性的檢測并鑒定出致病菌種類。Yang等［31］將IMS與mPCR技術結合檢測加標的生菜、西紅柿和碎牛肉中三種不同的細菌，結果發現，S.typhimurium、E.coli O157∶H7和L.monocytogenes的最低檢測限分別為5.1×103、7.5×103CFU/g和8.4× 103CFU/g。Wang等［32］將IMS與mPCR結合同時定量檢測牛肉樣本中的E.coli O157∶H7、Salmonella和Shigella，結果發現，最低檢測限分別為105、103CFU/g和104CFU/g。

表1 結合IMS的檢測方法在食源性致病菌檢測中應用的比較Table 1 Comparision for IMS combining with other technologies for the detection of foodborne pathogen

2.3 IMS-流式細胞術

流式細胞術（flow cytometry，FCM）是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，通過檢測標記的熒光信號，實現逐一和高速的細胞定量分析或分選的技術。FCM具有進行多參數分析、速度快等優點，是一種綜合性方法。Kyoko等［33］將IMS與FCM技術結合分離檢測食品樣本中L.monocytogenes，結果發現，該方法的檢測范圍達102～108CFU/m L，且檢測時間僅需1m in。

2.4 IMS-免疫傳感器

免疫傳感器的出現和發展正在促使免疫檢測手段朝電器化、自動化、簡便化和快速化方向發展。抗原與抗體的結合具有很高的特異性，從而減少了非特異性干擾，實時檢測抗原抗體的反應，進行定量檢測，即在抗原抗體反應的同時將反應連續記錄下來，以便進行動態分析。IMS與免疫傳感器相結合，可以提高靈敏度，降低檢測限；減少分析時間；簡化分析過程。Marcelo等［34］結合IMS與光纖免疫傳感器在熱狗中快速檢測L.monocytogenes和L.innocua，結果發現，檢測靈敏度為3×102CFU/m L。這兩種方法的結合，對檢測L.monocytogenes具有高效特異性，且可以在較低濃度下進行檢測。

2.5 IMS-免疫熒光技術

免疫熒光技術（immunofluorescence technique）是在免疫學、生物化學以及顯微鏡技術的基礎上發展起來的一項檢測技術，用熒光標記的抗體或抗原與待測樣品中相應的抗原或抗體進行結合，在顯微鏡下檢測熒光強度，并對樣品進行分析的方法。它把顯微鏡技術的精確性和免疫學檢測的特異性、敏感性有機地結合。該方法特異性強、靈敏度高。作為一種快速檢測方法，目前廣泛應用于致病菌的檢測。將IMS與免疫熒光檢測技術進行結合檢測致病菌，能極大的縮短檢測時間，提高檢測靈敏度。Cho等［35］將IMS與免疫熒光檢測技術相結合，分別檢測菠菜中的E.coli O157∶H 7、雞肉中的S.typhimurium和牛奶中的L.monocytogenes，結果發現，這兩種方法的結合極大的縮短了檢測時間僅需2h，及低于5CFU/m L的高檢測靈敏度。Wang等［36］將IMS與免疫熒光技術結合同時檢測三種食源性致病菌（S.typhimurium，E.coli O157∶H 7，L.monocytogenes），檢測時間低于2h，檢測靈敏度低于20～50CFU/m L。

3 總結與展望

目前常用的L.monocytogenes的檢測方法已有很多，大部分方法都需要對目標菌進行預增菌，使其達到檢測方法所需的最低檢測濃度。如何在食品基質中快速高效特異地分離出數量極少的食源性L.monocytogenes，實現對目標菌高特異性和高靈敏度的檢測，是食品安全領域一個亟待突破的環節。

IMS技術在食源性致病菌檢測中，作為一種可以短時高效富集基質中目的菌的技術，在一定程度上可以代替前增菌的過程。將IMS與各種常用的檢測方法進行結合，可以達到縮短檢測周期，提高靈敏度，增強特異性等作用，其優勢不斷體現，已被廣泛應用于食源性致病菌的分離檢測。但是，仍然還有許多值得改進的地方，例如IMS結合PCR技術的優化條件復雜，且優化獲得的程序不具有通用性，其適用性被大大地限制；IMS與免疫學方法以及流式細胞術結合存在著儀器價格昂貴，操作要求高，實驗材料制備復雜等問題。此外，在較復雜的食品基質中，IMS因磁場強度影響磁分離速度，分離效率以及IMS過程中磁性粒子對細菌體存在的潛在毒性等缺點也需要進一步研究［37］。另一方面，IMS結合其他的方法，如：拉曼增強［38-39］、免疫層析法［40］和免疫比濁法［41］等用于檢測常見致病菌已有研究，然而針對L.monocytogenes的檢測仍未報道，需要研究者們進一步探討。

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Research advance on immunomagnetic separation for detection of foodborne Listeria monocytogenes

MAO Yan，HUANG Xiao-lin，XU Heng-yi，XIONG Yong-hua*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Listeria monocytogenes was the only human foodborne pathogen of Listeria，which was responsiblefor listeriosis with high mortality rate of 30％ to 70％. Early prevention for L. monocytogenes was of the utmostimportance to reduce the disease mortality. Therefore，it was required to achieve the detection methods withrapidity，sensitivity and high specificity. Detection sensitivity of existing detection methods for L. monocytogeneswas low in food samples without pre-enrichment，limiting these methods directly used for rapid detection ofL. monocytogenes. Immunomagnetic separation was a technology which could efficiently enrich target bacteriain the sample within short time. This technology combined with commonly used detection methods could shortenthe detection period and improve the detection sensitivity. Recent advance of the application of immunomagneticseparation technology for the detection of foodborne L. monocytogenes was reviewed in this paper.

Listeria monocytogenes；immunomagnetic separation；detection

TS207.4

A

1002-0306（2015）08-0351-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.065

2014－06－19

毛燕（1990-），女，碩士研究生，研究方向：免疫磁分離。

*通訊作者：熊勇華（1970-），男，博士，研究員，研究方向：食品生物技術。

國家自然科學基金資助項目（81201691，31271863）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAK10B06）；高等學校博士學科點專項科研基金（20123601120005）；江西省教育廳基金資助項目（GJJ13093）。