鯽魚卵唾液酸糖蛋白對免疫功能低下小鼠的免疫調節作用

周曉春，于 哲，毛 磊，趙延蕾，王一名，王靜鳳

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

鯽魚卵唾液酸糖蛋白對免疫功能低下小鼠的免疫調節作用

周曉春，于 哲，毛 磊，趙延蕾，王一名，王靜鳳*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

從鯽魚卵中提取唾液酸糖蛋白，并探討其對免疫功能低下小鼠免疫功能的作用。Balb/c小鼠連續皮下注射氫化可的松造成免疫功能低下模型，以不同劑量的鯽魚卵唾液酸蛋白灌胃28d后，分別測定小鼠的抗體產生水平、T細胞免疫功能、非特異性免疫功能和血清IFN-γ/IL-4。結果顯示，高劑量的鯽魚卵唾液酸糖蛋白能顯著升高免疫低下小鼠的血清溶血素水平（p＜0.01）和抗體細胞生成數（p＜0.01），增強脾淋巴細胞增殖能力（p＜0.01）和遲發型變態反應（p＜0.05），顯著提高腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數（p＜0.01），改善碳廓清能力（p＜0.05）并升高血清中IFN-γ/IL-4水平（p＜0.01）。說明鯽魚卵唾液酸糖蛋白對免疫功能低下小鼠具有顯著的免疫調節作用。

鯽魚卵唾液酸糖蛋白，血清溶血素，脾淋巴細胞轉化，遲發型變態反應，IFN-γ/IL-4

魚卵是魚類加工過程中產生的重要副產物，目前除少量優質魚卵被用來加工為腌漬魚卵、魚子醬等初級食品形式外，大部分未被充分利用，造成了資源浪費。而魚卵含有生命體發育所需的全部營養成分，其營養價值很高。研究表明魚卵主要成分為蛋白質、脂質和礦物質，其中卵黃蛋白是主要成分，包括卵黃高磷蛋白、卵黃脂磷蛋白和β′組分［1-2］，富含糖蛋白組分。但目前對魚卵功效成分的研究主要集中在功能性脂質部分，而對魚卵中糖蛋白組分的研究尚未見報道。

本課題組前期經篩選研究發現，鯽魚卵中唾液酸含量豐富，從鯽魚卵中提取的唾液酸糖蛋白具有促進成骨細胞增殖的活性。另有研究報道，富含唾液酸糖蛋白的燕窩勻漿可以有效改善免疫低下小鼠的免疫功能，其免疫功能與唾液酸糖蛋白組分有關［3-4］。因此本研究以高唾液酸含量的鯽魚卵糖蛋白為研究對象，觀察了其對免疫功能低下小鼠的免疫調節作用，為魚卵資源的深度開發和綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鯽魚 體重約0.5kg，處于魚卵成熟期，購于青島市大連路水產品市場；BALB/c小鼠 雄性，4～6周齡，體重17～19g，SPF級，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號SCXK（京）-20120001；成年豚鼠 雌性，體重400～500g，山東魯抗制藥有限公司提供，動物證號SCXK（魯）-20030006，抽取其心血，常規分離血清，以壓積的綿羊紅細胞吸收后，作為本實驗的補體；健康公雞 購于青島市南山市場，抽取雞翼靜脈血，按常規方法制備雞紅細胞（Chicken red blood cell，CRBC）；N-乙酰神經氨酸（N-acetylneuram inicacid，NAG）、刀豆蛋白（ConA）、噻唑藍［（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］美國Sigma公司；綿羊紅細胞 濟南萬德廣聯醫療器械有限責任公司提供；氫化可的松注射液 西安利君制藥有限責任公司；鹽酸左旋咪唑 山東省莒南制藥廠；印度墨汁 北京篤信精細制劑廠產品；IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒 武漢博士德生物技術有限公司。

Aglient1100型高效液相色譜儀 美國Aglient公司；ALPHA1-4LD型冷凍干燥機 德國CHRIST公司；MR-23i型高速冷凍離心機 法國Jouan公司；LABOROTA4000型旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；2711型CO2培養箱 德國Heraeus公司；120型正置生物顯微鏡 日本Olympus公司；TGL-16G型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；鍍鉻游標卡尺（精度0.02mm） 江西工具廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白的制備 新鮮鯽魚，分離魚卵，低溫下剔除卵巢膜后高速攪拌破碎，冷凍干燥處理后，以15倍體積的95%乙醇脫脂12h，冷風干燥后得脫脂魚卵。脫脂魚卵以蒸餾水（脫脂魚卵/水= 1/30，V/V）攪拌提取兩次，8000r/m in低溫離心20m in，上清液合并后于45℃旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥，得鯽魚卵唾液酸糖蛋白。參照文獻方法［5］，以NAG為標準品、DAD串聯HPLC法測得其唾液酸含量為5.89%± 1.11%，Folin-酚法測得其蛋白含量為34.51%±2.00%，苯酚-硫酸法測得其粗多糖含量為6.06%±0.07%。

1.2.2 動物分組與模型建立 BALB/c小鼠，適應性喂養7d后，按體重隨機分為正常對照組（N），模型對照組（M），陽性對照組（P）和鯽魚卵唾液酸糖蛋白低、高劑量組（JL，JH），每組10只。劑量組小鼠灌胃不同濃度的鯽魚卵唾液酸糖蛋白溶液（10、50mg/kg·bw）。陽性對照組灌胃左旋咪唑（20mg/kg·bw），正常和模型對照組灌胃生理鹽水，灌胃體積10m L/kg·bw，1次/d，連續28d。于首次給藥后的第21d，正常對照組除外，其余各組小鼠均于頸部皮下注射氫化可的松（23mg/kg·bw），每天1次，連續7d，建立免疫功能低下小鼠模型，正常對照組注射等量生理鹽水。

1.2.3 血清溶血素的測定 首次給藥第23d時，各組小鼠腹腔注射0.2m L 5%（體積分數，以下SRBC的百分濃度均指體積分數）SRBC致敏。末次灌胃給藥后，摘眼球取血，分離血清。按血清∶生理鹽水=1∶100稀釋后，參考文獻方法［6］測定血清溶血素含量，計算半數溶血值（HC50）。

1.2.4 抗體生成細胞數的測定 小鼠致敏方法同1.2.3，末次給藥后，脫頸椎處死。無菌取脾，以RPM I-1640培養基制備脾細胞懸液（濃度為107個/m L）。于冰浴中，各試管依次加入脾細胞懸液、0.4%SRBC、1∶15豚鼠血清各0.5m L（對照管以生理鹽水代替脾細胞懸液），37℃水浴60m in，冰浴終止反應，3000r/m in離心5m in，上清液于450nm處測吸光值A。

1.2.5 遲發型變態反應（足跖增厚法）的測定 參照文獻方法［7］測定，以足跖增厚法來檢測小鼠的遲發型變態反應。小鼠致敏方法同1.2.3，致敏4d后，分別測量各組小鼠左后足跖厚度。測量部位足跖再次注射20μL 20%SRBC進行第二次致敏，24h后測量其厚度，并計算2次致敏前后足跖的厚度差值。

1.2.6 脾T淋巴細胞增殖能力的測定 于末次給藥后，小鼠脫頸椎處死。無菌取脾，制備小脾細胞懸液，脾T淋巴細胞轉化的測定方法參考文獻［7］。其中，脾淋巴細胞的接種濃度為5×106個/m L，ConA的終濃度為5μg/m L。于570nm處測定吸光值，脾淋巴細胞的增殖能力以加和不加ConA的吸光值的差值表示。

1.2.7 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的測定 于末次給藥后禁食不禁水12h，每只小鼠腹腔注射1m L 2%（體積分數）雞紅細胞懸液，30min后脫頸椎處死。小鼠腹腔巨噬細胞的收集、染色和計數參見文獻方法［6］，計算吞噬百分率和吞噬指數。

1.2.8 小鼠碳廓清能力的測定 末次給藥12h后，稱重。尾靜脈注射印度墨汁（以生理鹽水按1∶4稀釋），注射體積0.1m L/10g·bw。碳廓清能力測定方法參照文獻［6］。并計算小鼠巨噬細胞對血液內碳粒的吞噬指數。

1.2.9 血清IL-4和IFN-γ含量的測定 于末次給藥后，禁食不禁水12h，摘眼球收集血液，常規分離血清，參照ELISA試劑盒方法分別檢測血清IFN-γ和IL-4含量。

1.著重學習過程當中的評價。在學習過程中，學生的各方面能力都會得到不同程度的鍛煉，學生的創新意識也會展現，所以對過程的評價很重要。

1.2.10 統計學分析 采用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析，同時進行LSD兩兩比較，以p＜0.05為具有統計學意義上的差異。所有實驗結果均用（±s）表示。

2 結果與分析

2.1 對抗體水平和抗體細胞生成數的影響

血清溶血素水平和抗體細胞生成數代表了小鼠體內抗體生成細胞的抗體產生水平，反映了體液免疫功能［8］。血清溶血素以半數溶血值HC50表示。由表1可以看出，模型對照組小鼠的HC50和抗體細胞生成數比正常組分別下降了27.84%和58.24%（p＜0.01），表明模型建立成功。相比模型對照組，高劑量的鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著提高免疫功能低下小鼠的血清溶血素水平和抗體細胞生成數。其中高劑量組的HC50提高了36.21%（p＜0.01），抗體細胞生成數提高了37.16%（p＜0.01）。說明高劑量的鯽魚卵唾液酸糖蛋白對模型小鼠的體液免疫功能有顯著的改善作用。

表1 鯽魚唾液酸糖蛋白對小鼠抗體細胞生成數、足跖增厚值和脾淋巴細胞轉化的影響（n=10，±s）Table 1 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on HC50，Number of antibody-forming cells，DTH and T-cell transformation in immunocompromized mice（n=10，±s）

表1 鯽魚唾液酸糖蛋白對小鼠抗體細胞生成數、足跖增厚值和脾淋巴細胞轉化的影響（n=10，±s）Table 1 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on HC50，Number of antibody-forming cells，DTH and T-cell transformation in immunocompromized mice（n=10，±s）

注：#p＜0.05，##p＜0.01，與正常組比；*p＜0.05，**p＜0.01，與模型組比；表2、表3同。

組別 半數溶血值 抗體細胞生成數 足跖增厚值（mm） 脾淋巴細胞轉化正常組 76.12±5.93 0.261±0.004 0.42±0.03 0.124±0.014模型組 54.93±7.15## 0.109±0.007## 0.32±0.08# 0.069±0.008##陽性組 69.41±4.21** 0.100±0.007** 0.41±0.08* 0.112±0.010**低劑量組 63.84±6.06 0.101±0.003 0.31±0.07 0.076±0.004高劑量組 74.82±5.46** 0.150±0.009** 0.40±0.08* 0.105±0.020**

2.2 對脾T淋巴細胞增殖能力和遲發型變態反應的影響

脾T淋巴細胞的增殖能力和遲發型變態反應可以反映小鼠的T細胞免疫功能［9］。與正常對照組相比，模型對照組的脾T淋巴增殖能力降低了43.83%（p＜0.01），足趾增厚值降低了23.79%（p＜0.05）。經鯽魚卵唾液酸糖蛋白干預后，模型小鼠的T細胞增殖能力和足跖增厚值均有所提高。由表1可知，高劑量組的T細胞增殖能力和足跖增厚值分別提高了51.02%（p＜0.01）和24.86%（p＜0.05）。表明高劑量的鯽魚卵唾液酸糖蛋白可以顯著改善免疫功能低下小鼠的細胞免疫功能。

腹腔巨噬細胞的吞噬能力可以衡量小鼠體內單核-巨噬細胞的免疫功能，體現了非特異性免疫功能［10］。由表2可知，模型對照組小鼠的吞噬百分率和吞噬指數分別下降了25.50%和23.30%（p＜0.01）。灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬百分率和吞噬指數均顯著提高（p＜0.01）。數據顯示，高劑量組的吞噬百分率和吞噬指數分別提高了25.05%和22.22%（p＜0.01）。說明鯽魚卵唾液酸糖蛋白對免疫低下小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能有顯著改善作用。

2.4 對小鼠碳廓清能力的影響

小鼠血清內碳粒的廓清速率可以反映小鼠體內整個單核-巨噬細胞系統的吞噬功能［8］。由表2可以看出，與正常對照組相比，模型對照組小鼠的碳粒吞噬指數降低了20.00%。以鯽魚卵唾液酸糖蛋白灌胃后，高劑量組小鼠比模型組小鼠的碳粒吞噬指數升高了15.19%（p＜0.05），吞噬率提高了25.05%（p＜0.01）。

表2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對小鼠吞噬百分率、吞噬指數和碳廓清能力的影響（n=10±s）Table 2 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on phagocytic rate，phagocytic index and ablity ofcarbon clearance in immunocompromized mice（n=10，±s）

表2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對小鼠吞噬百分率、吞噬指數和碳廓清能力的影響（n=10±s）Table 2 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on phagocytic rate，phagocytic index and ablity ofcarbon clearance in immunocompromized mice（n=10，±s）

組別 吞噬百分率（%） 吞噬指數 碳廓清能力正常組 53.26±0.46 1.76±0.01 5.17±0.44模型組 39.28±0.66## 1.35±0.05## 4.14±0.78##陽性組 44.32±2.15** 1.59±0.07** 5.00±0.70*低劑量組 39.73±0.84 1.44±0.08 4.56±0.43高劑量組 49.12±1.58** 1.65±0.08** 4.76±0.14*

2.5 對血清IL-4和IFN-γ水平的影響

血清IFN-γ和IL-4分別是Th1和Th2細胞分泌的細胞因子，Th1細胞介導細胞免疫，Th2細胞介導體液免疫。IFN-γ/IL-4比值，可間接反映Th1/Th2的平衡狀態，是評價機體免疫狀態的綜合指標［11-12］。由表3可以看出，相比于正常對照組，模型對照組小鼠血清IL-4水平顯著上升（p＜0.01），IFN-γ/IL-4顯著降低（p＜0.01），表明模型組小鼠體內Th1/Th2動態平衡向Th2漂移，處于免疫抑制狀態。灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，高劑量組IL-4比模型組小鼠降低了27.72%（p＜0.01），而IFN-γ/IL-4值比模型組小鼠升高了34.16%（p＜0.01）。表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白可以活化Th1細胞，促進Th1/Th2回復到平衡狀態。

表3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對小鼠INF-γ，IL-4和IFN-γ/IL-4的影響（n=10，±s）Table 3 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on IFN-γ，IL-4 and IFN-γ/IL-4 in immunocompromized mice（n=10±s）

表3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對小鼠INF-γ，IL-4和IFN-γ/IL-4的影響（n=10，±s）Table 3 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on IFN-γ，IL-4 and IFN-γ/IL-4 in immunocompromized mice（n=10±s）

組別Group IFN-γ（pg/mL） IL-4（pg/mL） IFN-γ/IL-4正常組 425.07±11.84 77.25±12.07 5.34±0.63模型組 434.21±14.85 103.49±7.31## 4.21±0.32##陽性組 429.39±20.00 85.46±11.91** 5.10±0.69*低劑量組 431.05±31.49 93.02±7.31** 4.66±0.51高劑量組 420.61±34.95 74.80±4.76** 5.65±0.69**

3 結論與討論

機體的免疫系統包括具有免疫功能的器官、組織和分子等，分為特異性免疫和非特異性免疫。本研究主要從特異性免疫及非特異性免疫功能等方面評價鯽魚卵唾液酸糖蛋白對機體免疫功能的調節作用。實驗結果顯示，鯽魚卵唾液酸糖蛋使血清溶血素含量顯著提高了36.21%（p＜0.01），使抗體細胞生成數提高了37.21%（p＜0.01），并可顯著改善T細胞介導的遲發型變態反應、促進脾T細胞增殖，說明其能增強免疫低下小鼠的特異性免疫。同時，鯽魚卵唾液酸糖蛋白使巨噬細胞的吞噬指數和吞噬率分別顯著提高了25.05%和22.22%（p＜0.01），說明免疫功能低下小鼠的非特異性免疫功能被顯著改善。血清IFN-γ/ IL-4的升高表明其可以顯著逆轉免疫機能低下小鼠體內Th1/Th2的漂移，增強細胞免疫功能。

Matsuda等研究發現，雞蛋中的糖蛋白可以增強機體免疫力［13］。糖蛋白增強免疫調節能力的機理被認為是糖蛋白中特定的寡糖具有作為專一信息載體的能力而影響淋巴細胞的許多功能，包括有機體中細胞有絲分裂原的激活作用、細胞對毒素的反應和淋巴細胞對靶器官的作用等［14］。本研究的結果表明鯽魚卵中含有唾液酸的糖蛋白在50mg/kg·bw的劑量下，對免疫功能低下小鼠具有全面的免疫促進作用，所以鯽魚卵唾液酸糖蛋白可以作為免疫增強劑。但是唾液酸糖蛋白的結構和具體的免疫增強機制及其關系還需進一步著重研究和深入探討。

［1］Matsubara T，Ohkubo N，Andoh T，et al.Two forms of vitellogenin，yielding two distinct lipovitellins，play different roles during oocyte maturation and early development of barfin flounder，Verasper moseri，a marine teleost that Spawns pelagic eggs［J］.Developmental Biology，1999，213：18-32.

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Immunomodulatory effects of sialoglycoprotein in eggs ofCarassius auratus on immunocompromized mice

ZHOU Xiao-chun，YU Zhe，MAO Lei，ZHAO Yan-lei，WANG Yi-m ing，WANG Jing-feng*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Sialoglycoprotein was extracted from eggs of Carassius auratus，and its immunomodulatory effects onimmunocompromized mice were studied. Different dosage of sialoglycoprotein from eggs of Carassius auratuswas given to immunodepressive model mice induced by Hydrocortisone for 28d. The antibody level ，immunological function of T cell and level of serum interferon-γ （IFN-γ） and interleukin-4 （IL-4） wasmeasured. Results showed that high -dose of sialoglycoprotein could increased the hemolysin content andnumbers of antibody-forming cells（p＜0.01） and strengthened lymphocyte proliferation（p＜0.01） significantly. Itcould aslo increase toe incrassation（p＜0.01） and promote phagocytosis ability of celiac macrophage（p＜0.05）and serum IFN-γ/IL-4（p＜0.01） markedly. Data suggested that the sialoglycoprotein from Carassius auratushad significant immunomodulatory effects on immunocompromized mice.

sialoglycoprotein from eggs of Carassius auratus ；hemolysin ；spleen lymphocyte transformation ；delayed-type hypersensitivity；IFN-γ/IL-4

TS201.4

A

1002-0306（2015）08-0340-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.062

2014－07－17

周曉春（1989-），女，碩士研究生，研究方向：海洋生物活性物質。

*通訊作者：王靜鳳（1964-），女，博士，教授，研究方向：海洋生物活性物質。

國家自然科學基金（31371876）；山東省自主創新專項項目（2012CX80201）。