石榴花多糖醇提工藝的響應曲面法優化及其抗氧化活性研究

柯春林，李作美，路濱宇，錢時權，張 斌，袁 靜（.蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠33030；.復旦大學藥學院，上海003）

石榴花多糖醇提工藝的響應曲面法優化及其抗氧化活性研究

柯春林1，李作美1，路濱宇2，錢時權1，張 斌1，袁 靜1
（1.蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030；2.復旦大學藥學院，上海201203）

以石榴花為原料，用熱水浸提法提取其多糖。在單因素實驗的基礎上，運用Box-Behnken實驗設計，采用響應曲面法對石榴花多糖的醇提條件進行優化。結果表明最佳工藝為：提取時間4h，溫度76℃，料液比1∶52，在此基礎上進行驗證實驗，實測多糖得率為6.35%。同時，不同的體外抗氧化實驗結果表明石榴花多糖具有適度的還原力，較強的清除亞硝酸鹽（NO2-）和超氧自由基（O2-）的清除效果，較好的螯合金屬離子能力，而且石榴花多糖的抗氧化活性隨著多糖濃度的提高而增強。

石榴花，多糖，響應曲面，提取優化，抗氧化活性

石榴為石榴科石榴屬植物，在我國己有2000多年的栽培歷史。據不完全資料統計，我國石榴栽培面積達11萬余公頃，居世界第1位。石榴全身是寶，它的各個部分都含有豐富的活性物質，表現出很強的生物活性，然而對石榴活性物質的研究和開發多集中于石榴葉、石榴皮和石榴籽，對石榴花的研究報道較少［1-3］。石榴花紅色花朵居多，也有瑪瑙、粉紅、黃色和白色等，具有良好的觀賞價值和文化價值，同時石榴花營養豐富，具有較高的藥用價值，漸漸成為人們研究該植物的熱點［4］。石榴花為中藥和維吾爾常用藥，性平、澀，作為中藥可用于治療中耳炎、鼻衄、創傷出血。在維吾爾族醫學中素以“古麗娜”之稱而入藥，用于退翳，治神經衰弱和惡心［5］。已有的研究內容表明石榴花具有多種化學成分，如多酚類、黃酮類、三萜類、糖類、皂苷、花青素等多種化合物［6-8］。石榴花具有抗氧化活性、降血脂和降血糖作用［8-11］。據報道，石榴花中有多糖成分［12］。但目前很少有關于石榴花多糖制備技術的報道，也沒有關于其生物活性研究的報道。基于以上研究背景，本研究探索了石榴花多糖醇提工藝及其抗氧化活性，以期為石榴花的資源開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴花（紅瑪瑙籽，紅花） 安徽懷遠；菲洛嗪美國Sigma公司；葡萄糖、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚 國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、苯酚、濃硫酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、濃鹽酸、氯化亞鐵、亞硝酸鈉等 均為分析純。

WFZUV-2000型紫外-可見光分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵 鄭州長城儀器有限公司；RE-51AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；BL-220H型分析天平 日本Shimadzu公司；FW 100型粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；800B型低速離心機 上海安亭科學儀器廠；DZF-6030A型真空干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；PHB-4型酸度計 上海雷磁儀器廠；HH-4型恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 石榴花多糖提取工藝 工藝流程：石榴花→干燥→粉碎、過60目篩→乙醇索氏提取回流至無色→殘渣晾干→水浴浸提4h→減壓過濾→Sevage法脫蛋白→劇烈振蕩→靜置分離→濃縮至15mL左右→乙醇沉淀→減壓過濾→丙酮溶劑洗滌3次→低溫干燥→石榴花多糖備用［13］。

1.2.2 多糖的測定 采用苯酚-硫酸法測定樣品中石榴花多糖的含量［14］，多糖得率（%）=［粗多糖質量（g）/原料質量（g）］×100。

1.2.3 單因素實驗 石榴花多糖為水溶性多糖，易溶與水，本實驗主要考察提取時間、提取溫度和料液比對石榴花多糖得率的影響。初始條件為：料液比1∶60（g/m L）、提取溫度60℃、浸提時間2h、提取次數1次、pH7.0和醇沉濃度70%。取5份3g干燥后的石榴花粉末，保持初始條件的其他條件不變：設置提取時間1、2、3、4、5h，提取溫度45、55、65、75、85℃，料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70進行單因素實驗。

1.2.4 響應曲面實驗 在單因素實驗的基礎上，確定影響石榴花多糖提取效果的主要因素。以各因素為自變量，運用Design Expert 7.1.3軟件進行Box-Behnken設計，采用響應面法并以石榴花多糖得率為響應值（因變量Y），對料液比（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）的3因素3水平進行提取條件優化，設計方案見表1。

表1 實驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels in response surface analysis design

1.2.5 抗氧化實驗

1.2.5.1 還原力的測定 參照文獻［15］的方法，取不同濃度樣品溶液1.0m L于試管中，分別加入1.0m L磷酸鹽緩沖液和1.0m L K3（Fe（CN）6）溶液，混勻，在50℃水浴中加熱20min，取出后迅速冷卻，加入1.0m L三氯乙酸混勻后，再加入0.2m L FeCl3溶液，混勻，10m in后測定700nm吸光值，3次重復。以水代替FeCl3溶液作空白對照。以吸光值（A1-A2）表示樣品還原力，A1—表示樣品管吸光值，A2—表示樣品空白管吸光值。

1.2.5.2 對亞硝酸鹽（NO2·-）的清除作用 參照文獻［16］的方法，分別吸取不同濃度的樣品液3m L于25m L容量瓶，加入5μg/m L的亞硝酸鈉2m L。檸檬酸-檸檬酸鹽緩沖液5m L，37℃水浴中反應15min后，立即加入0.4%對氨基苯磺酸溶液2m L，混勻靜置5m in，加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液1m L，用蒸餾水定容至25m L。15m in以后，然后以空白試劑作對照測定吸樣的品光度A538nm，重復做3次實驗，取平均值。空白組：以蒸餾水代替樣品。按下式計算清除率：NO2-清除率=（A1-A2）/A1×100。A1—未加樣品時吸光值；A2—加樣品后吸光值。

1.2.5.3 對超氧自由基（O2-·）的清除作用 采用鄰苯三酚自氧化法［17］，取0.05mol/L pH為8.2的Tris-HCl緩沖液6m L加入盛有2.2m L蒸餾水的試管中。置于25℃水浴中預熱20m in。分別精確吸取不同濃度的多糖溶液0.5m L。即加入在25℃水浴中預熱過的鄰苯三酚1m L，立即混勻。在25℃水浴中準確反應4m in后，加入8mol/L的HCl溶液0.1m L終止反應。然后以空白作對照測定樣品在325nm處的吸光度，做3次平行實驗，取平均值。按下式計算清除率：O2-·清除率=（A1-A2）/A1× 100。其中：A1—空白管吸光值；A2—樣品管吸光值。

1.2.5.4 螯合金屬離子能力 根據文獻［18］的方法稍作改進，取不同濃度樣品溶液1.0m L于試管中，分別加入0.05m L FeCl2溶液、0.2m L菲洛嗪溶液、2.75m L水，混勻，10m in后測吸光度A562nm，重復3次，取平均值。以水代替FeCl2溶液做空白對照。螯合率（%）=［A0-（A1-A2）］/A0×100其中：A0—水代替樣液時的吸光值；A1—樣品管吸光值；A2—樣品空白管吸光值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

由圖1（a）可知在1～4h時隨著時間的延長，多糖得率增加的幅度較大，4h后多糖得率增加不明顯，這時多糖在固-液之間的濃度基本達到了平衡；如圖1（b）所示，在45～75℃時隨著溫度的提高多糖得率逐漸升高，75℃時達到峰值；75℃時以后，溫度繼續增加，多糖得率反而下降，可能的原因是多糖在溫度過高時會降解；從圖1（c）可以看出，在料液比1∶30～1∶50時隨著提取溶劑的增加，多糖得率上升，繼續增加提取溶劑，料液比超過1∶50后提取效果有降低的趨勢，可能此濃度下，石榴花和熱水組成的溶液體系中，溶質飽和，多糖已基本溶解，石榴花多糖不能充分溶解析出，而且提取溶劑過多的情況下不利于后續的濃縮純化過程。所以本實驗選取3個主要影響因素提取時間、提取溫度和料液比，對應的水平分別為：3、4、5h；65、75、85℃；1∶40、1∶50和1∶60。

圖1 浸提時間（a）、溫度（b）和料液比（c）對多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction time，temperature and solvent/ material ratio on polysaccharides yields

2.2 響應曲面實驗

2.2.1 Box-Behnken實驗結果 以多糖得率為響應值，響應面實驗結果見表2，方差分析結果表明（表3）：模型極顯著（p＜0.0001），失擬項不顯著（p=0.0552＞0.05）。模型的校正系數R2adj=0.9899，說明該模型可以解釋98.99%的響應值的變化，相關系數為R2=0.9956，表明該模型與實際擬合非常好，實驗誤差小。其中提取時間以及料液比對響應值具有極顯著的影響（p＜0.0001），提取溫度對響應值的影響不顯著（p＞0.05）。時間和溫度、時間和料液比間的交互作用對響應值影響極顯著（p＜0.0001），溫度和料液比之間的交互影響對響應值極顯著（p＜0.01）。將所得實驗數據進行多元回歸擬合，得到各因素對石榴花多糖得率Y的回歸方程：

2.2.2 響應曲面分析 根據擬合函數，固定一個因素在“0”水平處理，分析另外2個因素對多糖得率的影響，做響應面分析，得到各因子交互作用響應面圖（圖2）。由圖2（a）、圖2（b）和圖2（c）可知，它們的等高線圖為橢圓形，而且曲率半徑較大，表示交互作用很明顯。所以提取時間和料液比、提取溫度和料液比、提取溫度和時間對石榴花多糖得率的交互作用極顯著。

表2 Box-Behnken Design實驗設計與實驗響應結果Table 2 Box-Behnken designmatrix and the response values for the yield of polysaccharides

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Analysis of variance for the response surface quadraticmodel

2.2.2 驗證實驗 根據響應曲面實驗結果并結合實際得出最佳提取工藝：料液比（1∶52）、溫度（76℃）、時間（4h）和乙醇濃度（70%），理論計算多糖得率為6.35%。在此基礎上進行驗證實驗，共計3次，實測多糖得率為6.35%，雖然低于11號實驗組的6.496%，但節約了1h，料液比下降了8個點，明顯降低了成本。即在確定的優化工藝條件下，能夠獲得較大石榴花多糖得率。

2.3 抗氧化實驗結果

2.3.1 還原力 多糖還原力是其潛在抗氧化能力的一個重要衡量指標［19］。由圖3看出，當石榴花多糖的濃度在0.052～0.260mg/m L范圍內時，隨著多糖濃度的增加，多糖溶液總還原力也在明顯增強，也即在此濃度范圍內，多糖能將反應溶液中的Fe3+還原為Fe2+，表明石榴花多糖具有較好的還原能力。

圖2 浸提時間和料液比（a）、浸提溫度和料液比（b）、浸提溫度和時間（c）對多糖得率的影響Fig.2 Effects of time and solvent/material ratio（a），temperature and solvent/material ratio（b），temperature and time（c）on polysaccharides yield

圖3 石榴花多糖的還原力Fig.3 The reductive potential by polysaccharides from pomegranate flowers

2.3.2 對亞硝酸鹽（NO2-）的清除能力 圖4為石榴花多糖清除亞硝酸鹽的情況。在0.009～0.044mg/m L濃度范圍內，石榴花多糖清除亞硝酸鹽的活性具有劑量依賴關系。尤其在0.009～0.017mg/m L隨著樣品濃度的增大，多糖對亞硝酸鹽的清除能力快速增長。在0.044mg/m L濃度時，多糖對亞硝酸鹽的清除率達到49.1%。本結果說明石榴花多糖具有明顯的清除亞硝酸鹽的能力。

圖4 石榴花多糖對亞硝酸鹽的清除能力Fig.4 The nitrite scavenging effectby polysaccharides from pomegranate flowers

2.3.3 對超氧自由基（O2-·）的清除效果 由圖5可知，在0.022～0.067mg/m L范圍內，石榴花多糖對O2-·清除作用顯著提高，但是當石榴花多糖的濃度在0.067～0.112mg/m L范圍內時，多糖對O2-·清除活性只是緩慢增長。在石榴花多糖的濃度達到0.112mg/m L時石榴花多糖對超氧自由基（O2-·）的清除率達到53.08%。由此可見石榴花多糖對O2-·具有一定的清除作用。

2.3.4 螯合金屬離子的能力 螯合金屬離子的能力是抗氧化活性的一種表現［18］。如圖6可知，隨著多糖濃度的增加，石榴花多糖對金屬離子的螯合率逐漸加強，在0.055～0.109mg/m L隨著樣品濃度的增大，多糖螯合率顯著增加，顯示出較好的螯合亞鐵離子能力。樣品濃度在0.164～0.273mg/m L之間，螯合率逐漸增長。

3 結論

采用響應面分析法優化石榴花多糖的醇提條件，結果表明最佳提取工藝為：時間4h，溫度76℃，料液比1∶52。在此基礎上進行驗證實驗，實測多糖得率為6.35%。通過不同的體外抗氧化實驗方法測定石榴花提取液中多糖的抗氧化性活性，結果顯示石榴花多糖具有適度的還原力，較強的清除亞硝酸鹽（NO2-）和超氧自由基（O2-·）的清除效果，較好的螯合金屬離子能力，而且石榴花多糖的抗氧化活性隨著多糖濃度的提高而增強。

Study on optimization of extraction conditions for polysaccharide from pomegranate flowers and its antioxidant activities

KE Chun-lin1，LIZuo-mei1，LU Bin-yu2，QIAN Shi-quan1，ZHANG Bin1，YUAN Jing1
（1.Department of Biotechnology and Food Engineering，Bengbu College，Bengbu 233030，China；2.School of Pharmacy，Fudan University，Shanghai201203，China）

Pomegranate flowers as row material were used for extraction polysaccharide with hot water. On thebasis of single factor experiments，the optimized extraction conditions for polysaccharides were determined byusing response surface methodology through the Box -Behnken design. The optional conditions were as follows:extraction time 4 hours，temperature 76℃，ratio of raw material to solvent 1∶52. Under the conditions，the yield of6.35％ was obtained by the verification experiment. And the polysaccharides from pomegranate flowersshowed moderate reducing power，strong clearance rate of nitrite（NO2-）and super oxygen free rad ical（O2-）and the ability to chelate metal ions，and the antioxidant activity of polysaccharides increased with the improvement of the polysaccharide concentration.

pomegranate flowers；polysaccharides；response surface analysis；extraction optimization；antioxidant activity

TS281.1

B

1002-0306（2015）08-0286-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.051

2014-04-14

柯春林（1976-），男，博士，副教授，主要從事糖生物學和糖生物工程方面的研究。

安徽省自然科學基金項目（1408085MH209）；安徽省高等學校省級自然科學基金項目（KJ2012B094）；安徽省大學創業訓練計劃項目（AH20141305065）。