SDS/正辛醇/異辛烷反膠束體系萃取葵花籽粕蛋白工藝研究

趙 萍，佐 玲，郭求實，王 雅

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050）

SDS/正辛醇/異辛烷反膠束體系萃取葵花籽粕蛋白工藝研究

趙 萍，佐 玲，郭求實，王 雅*

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050）

利用SDS（十二烷基磺酸鈉）/正辛醇/異辛烷反膠束體系對葵花籽粕蛋白進行萃取，探討在超聲輔助萃取下，W0、緩沖液pH、緩沖液濃度、料液比（g/mL）、溫度、時間以及表面活性劑濃度等對蛋白質前萃取率以及后萃取率的影響。結果表明：前萃取工藝的最佳條件SDS濃度為0.07g/mL，料液比為1∶25，鹽濃度為0.07mol/L，pH為6.5，W0=27，萃取時間為35min，溫度為40℃；后萃取最佳工藝條件為：鹽濃度為0.9mol/L、緩沖液pH為7.5、萃取時間為45min、萃取溫度為35℃，在此條件下，蛋白質的前萃率為89.93%，后萃率為65.01%，蛋白質提取率為58.46%。

反膠束，葵花蛋白，前萃取，后萃取

葵花籽粕，也稱為葵花粕，是葵花籽經預壓榨或直接浸出法榨取油脂后的一種副產品，含有豐富的優質蛋白（29%～43%），其中球蛋白占55%～60%，清蛋白占17%～23%，谷蛋白占11%～17%，醇溶谷蛋白占1%～4%，是植物蛋白的重要來源之一［1］。葵花籽蛋白中氨基酸的組成，除賴氨酸的含量較低外，其余必需氨基酸均達到或高于聯合國糧農組織推薦的標準［2］。但目前這些高營養價值的葵花籽粕利用率不高，通常主要用作牛的飼料以及其他家禽等的飼料，產品增值太低。反膠束是表面活性劑分散于連續有機相中而自發形成的納米尺度的聚集體，源于20世紀70年代的液液萃取技術。在反膠束溶液中，表面活性劑的非極性基團在外，而極性基團則排列在內形成一個極性核，此極性核吸收水后形成“水池”，以W0表示其大小［3］。當反膠束溶液與含有蛋白質等組分的水溶液接觸后，蛋白質及其他親水性物質能夠進入“水池”內（稱為“前萃”），而與其他不能進入反膠束極性核的物質分離開來［4］。由于周圍水層形成的水化膜和靜電斥力的作用，保證了蛋白質的天然構象不被破壞。再將含有蛋白質的反膠束溶液與反萃取緩沖溶液混合，蛋白質轉移到緩沖溶液中，然后將反膠束分離，最終從緩沖液中得到蛋白質（稱為“后萃”）。反膠束萃取技術因其萃取率高，污染小，所用溶劑可以回收重復利用等優點日益受到廣大學者的關注。目前，已有學者利用反膠束萃取技術進行大豆蛋白［5］、玉米胚芽蛋白［6］、花生蛋白［7］、杏仁蛋白［8］等植物蛋白提取的研究，但多集中于前萃取過程，后萃取過程鮮有研究。

因此，本文利用SDS（十二烷基磺酸鈉）/正辛醇/異辛烷反膠束體系對葵花粕蛋白進行萃取研究，討論了在超聲輔助萃取下，W0、緩沖液pH、鹽濃度、料液比、溫度、時間以及表面活性劑濃度等因素對前萃取率以及后萃取率的影響，實現了葵花粕中蛋白質的萃取，并試圖找到其最佳提取工藝，從而為葵花粕的深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葵花粕 甘肅敬業科技有限公司提供；SDS（十二烷基磺酸鈉）、異辛烷、正辛醇、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、卡爾費休試劑、硫酸銅（CuSO4·5H2O）、硼酸、氫氧化鈉、濃硫酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、無水乙醇 均為分析純。

JY99-IIDN超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE52-86A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；CJJ78-1磁力攪拌器 上海梅香儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；TC16-WS高速離心機 長沙相依離心機有限公司；PHB-5型便攜式酸度計 中國杭州雷磁分析儀器廠；KLS-411型微量水份分析儀 上海精密科學儀器有限公司；FA2004電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；101-2A電熱鼓風干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；CHA-S/SH 2-82氣浴恒溫振蕩培養器 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料中蛋白質和水分含量測定 水分測定：GB 5009.6-2010；粗蛋白測定：GB 5009.5-2010。

1.2.2 反膠束溶液的配制 稱取一定量的表面活性劑SDS，置于250m L燒杯中，同時加入有機溶劑正辛醇/異辛烷（體積比為1∶4），并加入含有一定濃度KCl的KH2PO4-Na2HPO4（可配制成不同pH）磷酸鹽緩沖溶液，磁力攪拌至SDS完全溶解，室溫靜置至溶液澄清透明即為反膠束溶液［9］。

1.2.3 反膠束溶液中含水量測定 采用卡爾費休法測定含水量（W0），W0=反膠束溶液中水的摩爾濃度/反膠束溶液中表面活性劑的摩爾濃度。

1.2.4 蛋白質前萃實驗 分別稱取不同質量SDS（4、6、7、8、9、10g），置于250m L燒杯中，同時加入有機溶劑正辛醇/異辛烷（體積比為1∶4）100m L，并加入不同濃度（0.04、0.05、0.06、0.08、0.10、0.12mol/L）不同pH的含KCl的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液（pH=6、6.5、7、7.5、8、8.5）以控制含水量W0（22、23、24、25、26、27），增溶水后取上述配制的SDS/正辛醇/異辛烷反膠束溶液按不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）加入葵花粕（精確到0.0001g），超聲（300W）輔助萃取10m in后轉移至恒溫水浴鍋中以不同溫度（25、30、35、40、45、50℃）繼續萃取不同時間（20、30、40、50、60、70m in），然后以4000r/m in離心分離10m in，萃取體系分為兩層，凱氏定氮法測定上層溶液萃取的蛋白含量，計算蛋白質的前萃取率［10］。

蛋白質前萃率（R，%）=（上層溶液蛋白質的含量/原料中蛋白質含量）×100

每次單因素實驗時依次僅改變一個變量，依次改變反膠團含水量W0、表面活性劑濃度、料液比、溫度、緩沖液pH、鹽濃度、時間進行單因素實驗。并根據單因素結果選取4因素3水平進行正交實驗，因素水平表如表1所示。

表1 前萃取因素水平表Table 1 Factors and levels of forward extraction orthogonal test

1.2.5 蛋白質后萃實驗 將20m L前萃液加入等體積的不同濃度（0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mol/L）的KCl的緩沖溶液（NaH2PO4-Na2HPO4配制）（pH=6.5、7、7.5、8、8.5、9.0），在恒溫振蕩培養器中以不同溫度（25、30、35、40、45、50℃）相同速度振蕩不同時間（30、40、50、60、70、80min）。然后將上述溶液置于離心機中，在4000r/m in下離心10m in，分液漏斗分層后取下層水相凱氏定氮法測定蛋白質含量［11］。

蛋白質后萃率（R，%）=（水相中蛋白質含量/反膠束溶液中蛋白質含量）×100

蛋白質總提取率（%）=（前萃率×后萃率）×100

每次單因素實驗時依次僅改變一個變量，實驗時依次改變鹽濃度、緩沖液pH、時間、溫度進行單因素實驗。并根據單因素結果選取4因素3水平進行正交實驗，因素水平表如表2所示。

表2 后萃取因素水平表Table 2 Factors and levels of backward extraction orthogonal test

1.3 數據分析

數據分析采用SPSS 17.0軟件進行分析。

2 結果與討論

經測定，葵花粕原料中蛋白質和水分含量分別為42.67%、3.84%。

2.1 葵花蛋白前萃實驗

2.1.1 W0對蛋白質前萃率的影響 由圖1可以看出，隨著W0的增大，蛋白質的前萃率呈現先增大后減小的趨勢，當W0達到26時，前萃率達到最大值。W0的增大意味著反膠團直徑的增大，當反膠團直徑與蛋白質大小近似時，蛋白質才可以增溶到反膠團中，實現蛋白質的萃取［12］。因此，本實驗選取W0=26進行后續實驗。

圖1 W0對前萃率的影響Fig.1 The effect ofW0on forward extraction rate

2.1.2 SDS濃度對蛋白質前萃率的影響 如圖2所示，隨著SDS濃度的增加，蛋白質的萃取率也隨之增加，當達到0.08g/m L時達到最大值。這是因為在非極性溶劑中單位體積內表面活性劑所形成的反膠團數量越多，就可以萃取更多的蛋白質，并且SDS濃度的增加會使整個體系極性增加，致使反膠團與蛋白質分子間作用力增強，利于蛋白質的吸附。由圖2可以看出，當SDS濃度為0.08g/m L時，蛋白質萃取率達到最大值。故選取SDS濃度為0.08g/m L。

圖2 SDS濃度對前萃率的影響Fig.2 The effect of SDS concentration on forward extraction rate

2.1.3 料液比對蛋白質前萃率的影響 圖3所示為料液比對蛋白質前萃率的影響，隨著料液比從1∶5變化到1∶25，蛋白質萃取率呈增長趨勢，1∶25時達到最大值而后又呈現減小趨勢。其原因可能是：當一定體積的反膠束溶液萃取蛋白質達到飽和后，剩余溶液中的蛋白質會破壞已穩定的反膠團-蛋白質體系，導致萃取率下降。由此也可以看出一定體積的反膠束溶液可萃取的蛋白質是有限的。故選取料液比1∶25為宜，這與郭曉歌、趙俊廷等研究結果相符合［3-4］。

圖3 料液比對前萃率的影響Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on forward extraction rate

2.1.4 溫度對蛋白質前萃率的影響 由圖4所示，隨著溫度的升高，蛋白質萃取率逐漸增大，直到40℃后逐漸減小。伴隨著溫度的升高，分子運動加快，蛋白質的萃取速率也加快，但過高的溫度，會導致反膠束-蛋白質體系的破壞。另一種解釋為，隨著溫度的升高，反膠團內增溶的水含量變多，反膠團增溶水能力的增加將會導致蛋白質溶解于反膠團能力的增加，因為蛋白質進入反膠團的過程是伴隨著水包圍在蛋白質外層［13］，因此溫度選取為40℃。

圖4 溫度對前萃率的影響Fig.4 The effect of temperature on forward extraction rate

2.1.5 緩沖液pH對蛋白質前萃率的影響 圖5所示為緩沖液pH對前萃率的影響，隨著緩沖液pH的增加，蛋白質的萃取率呈現先增加后減小的趨勢，當pH=6.5時，前萃率最大。緩沖溶液的pH影響蛋白進入反膠團主要因為它改變了蛋白質分子表面的電荷分配。葵花蛋白p I=4.0，當體系pH大于葵花蛋白質等電點時，蛋白質帶負電，此時靜電作用不足以使蛋白質進入到反膠團中［14］，則可能是離子交換機理和蛋白質的疏水性起主導作用。因此pH逐漸增大，蛋白質萃取率逐漸減小，所以pH=6.5較適宜。

圖5 緩沖液pH對前萃率的影響Fig.5 The effect of buffer pH on forward extraction rate

2.1.6 鹽濃度對蛋白質前萃率的影響 如圖6所示，蛋白質的前萃率隨著鹽濃度的增加而增加，直到鹽濃度達到0.08mol/L達到最大值，隨后逐漸減小。鹽濃度影響了蛋白質進入反膠束的傳質過程，因為緩沖液中鹽的濃度影響反膠團的尺寸同時影響蛋白質和反膠團之間的靜電作用［15］。當濃度超過0.08mol/L后，伴隨著鹽濃度的不斷增加，前萃率減小這是因為產生了“屏蔽效應”而使靜電相互作用減弱，從而抑制了蛋白質和水的的增溶［13］，因此鹽濃度選取0.08mol/L較好。

圖6 鹽濃度對前萃率的影響Fig.6 The effect of buffer concentration on forward extraction rate

2.1.7 時間對蛋白質前萃率的影響 圖7為萃取時間對前萃率的影響曲線，30m in時萃取率最大，這說明SDS/正辛醇/異辛烷體系萃取葵花蛋白達到最大萃取效果的時間較短。萃取時間從30～80m in時，隨著萃取時間的增加，萃取率有所下降，這可能是因為隨著萃取的進行，增溶到反膠團中的蛋白質達到飽和，隨著時間的繼續增加，反膠團由于離子強度等因素影響而發生了滲濾現象，使反膠團結構破壞，導致提取率下降，故選取萃取時間為30m in。

圖7 萃取時間對前萃率的影響Fig.7 The effect of extraction time on forward extraction rate

2.1.8 前萃正交實驗 根據前萃單因素實驗分析結果，選取4個主要因素進行4因素3水平正交實驗，結果見表3。

根據表3對所得數據進行直觀極差分析，由R值的大小我們可以看出，對前萃率影響由大到小的因素為：B＞D＞C＞A，即影響因素從主到次為：緩沖液濃度＞萃取時間＞W0＞SDS濃度，由k值可以得出最佳提取條件為：A1B1C3D3，即SDS濃度為0.07g/m L、鹽濃度為0.07mol/L、W0=27、萃取時間為35m in的條件為最佳提取條件。在此最佳條件下，進行驗證實驗，蛋白質的前萃率為89.93%，高于表中其他組合的前萃率。由表4可以看出，當用離均差平方和最小項W0作為誤差來檢驗其他因素對前萃取率作用的顯著性時，SDS濃度、萃取時間對前萃取率影響均顯著。

表3 正交試驗表Table 3 Orthogonal experiment table

表4 前萃正交試驗方差分析Table 4 Significant analysis on forward extraction orthogonal test

2.2 葵花蛋白后萃實驗

2.2.1 鹽濃度對蛋白質后萃率的影響 由圖8可以看出，隨著鹽濃度的增大，蛋白質的后萃率在鹽濃度為0.8mol/L時達到最大值，隨后先增大后減小。這是因為隨著鹽濃度的增加，反膠團增容量逐漸減小，蛋白質隨著反膠團增容量的減小而逐漸溶出。同時，由于蛋白質不斷溶出到后萃水相體系中，致使反膠束“水池”中與水相中蛋白質形成濃度差，不斷促進蛋白質反萃取到水相中，因此在鹽濃度未達到0.8mol/L時，蛋白質后萃率逐漸增大。但當濃度過高時，蛋白質會由于鹽析作用致使后萃率趨于減小［16］。因此本實驗選取鹽濃度為0.8mol/L進行后續實驗。

2.2.2 緩沖液pH對蛋白質后萃率的影響 如圖9所示，隨著緩沖液pH的增加，蛋白質的萃取率也隨之增加，當pH達到8時為最大值。這是由于隨著pH的不斷增加，蛋白質表面電荷量增加，并且與反膠束表面所帶電荷同性。因此，隨著pH的增加，靜電斥力不斷增大，蛋白質在反膠束中的增溶逐漸減小，蛋白質的后萃率也隨之增大。故選取pH=8進行后續實驗。

圖8 鹽濃度對后萃率的影響Fig.8 The effect of salt concentration on backward extraction rate

圖9 緩沖液pH對后萃率的影響Fig.9 The effect of buffer pH on backward extraction rate

2.2.3 時間對蛋白質后萃率的影響 圖10所示為時間對蛋白質后萃率的影響，隨著時間從30m in增加到40m in，蛋白質后萃取率呈增長趨勢，40m in時達到最大值而后呈現減小趨勢。其原因可能是：當體積一定時反膠束后萃溶液萃取蛋白質的能力是有限的，因此即使時間延長，蛋白質的后萃取量也不會再增加。40m in后，蛋白質后萃取率呈現略微減小后趨于平穩的趨勢，故選取后萃取時間為40m in為宜。

圖10 時間對后萃率的影響Fig.10 The effect of time on backward extraction rate

2.2.4 溫度對蛋白質后萃率的影響 由圖11所示，隨著溫度從25℃上升到40℃，蛋白質后萃取率逐漸增大，直到40℃后逐漸減小。這是因為伴隨著溫度的升高，反膠團增溶能力逐漸減小，分子運動加快，蛋白質不斷被釋放出來進入后萃水相體系中，因此蛋白質的后萃取率增加。因此選取溫度為40℃。

圖11 溫度對后萃率的影響Fig.11 The effect of temperature on backward extraction rate

2.2.5 后萃正交實驗 根據后萃單因素實驗分析結果，選取4個因素進行4因素3水平正交實驗，結果見表5。

表5 正交實驗表Table 5 Orthogonal experiment table

表6 后萃正交試驗方差分析Table 6 Significant analysis of backward extraction orthogonal test

根據表5對所得數據進行直觀極差分析，由R值的大小我們可以看出，對葵花蛋白后萃率影響由大到小的因素為：A＞C＞B＞D，即影響因素從主到次為：鹽濃度＞萃取時間＞緩沖液pH＞萃取溫度，由k值可以得出最佳提取條件為：A3B1C3D1，即鹽濃度為0.9mol/L、緩沖液pH為7.5、萃取時間為45m in、萃取溫度為35℃的條件為最佳提取條件。在此最佳條件下，進行驗證實驗，葵花蛋白的后萃率為65.01%，高于表中其他組合的后萃率。由表6可以看出，當用離均差平方和最小項萃取時間作為誤差估計來檢驗其他因素作用的顯著性時，鹽濃度、緩沖液pH、萃取溫度三個因素對后萃取率影響均極顯著。根據1.2.5中公式計算可得，蛋白質的提取率為58.46%。

3 結論

通過對SDS（十二烷基磺酸鈉）/正辛醇/異辛烷反膠束體系對葵花粕蛋白前萃單因素及正交實驗得到SDS濃度為0.07g/m L、料液比（g/m L）為1∶25、鹽濃度為0.07mol/L、W0=27、萃取時間為35min、萃取溫度為40℃、緩沖液pH為6.5的條件為最佳提取條件。在此最佳條件下，蛋白質的前萃率為89.93%。通過對SDS/正辛醇/異辛烷反膠束體系對葵花粕蛋白后萃單因素及正交實驗得到鹽濃度為0.9mol/L、緩沖液pH為7.5、萃取時間為45min、萃取溫度為35℃的條件為最佳提取條件。在此最佳條件下，蛋白質的后萃率為65.01%，蛋白質提取率為58.46%。

［1］ShahidiF，Han X，Synowiecki J.Production and characteristics of protein hydrolysates from capelin（Mallotus villosus）［J］.Food Chemistry，1995，53（3）：285-293.

［2］陳彥.葵花籽分離蛋白的制取工藝［J］.中外技術情報，1995（1）：45.

［3］趙曉燕，薛文通，陳復生，等.影響反膠束體系萃取蛋白能力的因素及機理［J］.農業工程學報，2009（11）：354-360.

［4］郭曉歌，趙俊廷.反膠束體系萃取葵花籽仁中蛋白質的研究［J］.食品工業科技，2008（4）：185-188.

［5］趙曉燕.反膠束萃取大豆蛋白質結構與特性研究［D］.北京：中國農業大學，2007.

［6］李飛，朱科學，周惠明，等.反膠束法同時提取玉米胚芽中蛋白質和油脂的前萃工藝研究［J］.中國油脂，2009（11）：27-30.

［7］孫秀平，陳軍，陳鋒亮，等.不同反膠束體系對萃取花生蛋白的影響［J］.食品科技，2012（1）：164-168.

［8］孫曉宏，朱科學，周惠明.反膠束法提取小麥胚芽蛋白前萃工藝的優化［J］.中國糧油學報，2008（4）：38-42.

［9］趙俊廷.反膠束溶液同時萃取油和蛋白質的工藝研究［J］.鄭州工業大學學報，2001（2）：54-56.

［10］陳復生，程小麗，李里特，等.超聲波技術在SDS反膠束萃取中的應用研究［J］.中國食品添加劑，2010（3）：147-153.

［11］張潔，陳復生，趙俊廷.SDS/正辛醇/異辛烷反膠束體系后萃大豆蛋白的研究［J］.食品科學，2005（S1）：222-226.

［12］C?klen K E，Hatton T A.Protein Extraction Using Reverse Micelles［J］.Biotechnology Progress，1985，1（1）：69-74.

［13］NoritomiH，Kojima N，Kato S，etal.How can temperature affect reverse micellar extraction using sucrose fatty acid ester［J］. Colloid and Polymer Science，2006，284（6）：683-687.

［14］Adachi M，Harada M.Solubilization mechanism of cytochrome c in sodium bis（2-ethylhexyl）sulfosuccinate water/ oilmicroemulsion［J］.The Journal of Physical Chemistry，1993，97（14）：3631-3640.

［15］Andrews B A，Haywood K.Effect of pH，ion type and ionic strength on partitioning of proteins in reverse micelle systems［J］. Journal of Chromatography A，1994，668（1）：55-60.

［16］陳茂深，朱科學.反膠束法提取花生蛋白后萃工藝的優化［J］.中國油脂，2010（1）：24-27.

SDS/isooctane/octanol reverse micellar extraction process of sunflower seed meal protein

ZHAO Ping，ZUO Ling，GUO Qiu-shi，WANG Ya*
（College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China）

Using reverse micelles of SDS（Sodium dodecyl sulfate）/isooctane/octanol extraction of sunflower seed protein，discussed in the ultrasound assisted extraction，study effect of W0，buffer pH，buffer concentration，solid-liquid ratio，temperature，time and surfactant concentration on the extraction rate of protein forward and backward extraction.The results showed that:the optimum conditions of forward extraction process for the concentration of SDS was 0.07g/m L，the ratio of material to liquid was 1∶25（g/m L），buffer concentration of 0.07mol/L，pH6.5，W0=27，extraction time was 35m in，temperature was 40℃ condition for.Backward extraction optimum conditions were:the salt concentration was 0.9mol/L，pH value of buffer solution was 7.5，extraction time was 45m in，the extraction tem perature was 35℃，under these conditions，the forward extraction rate of protein was 89.93%，backward extraction rate was 65.01%，the total extraction rate of protein was 58.46%.

reverse micelle；sunflower protein；forward extraction；backward extraction

TS201.1

B

1002-0306（2015）08-0262-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.046

2014－07－21

趙萍（1964-），女，碩士，教授，主要從事食品科學、農產品加工與副產物綜合利用方面的研究。

*通訊作者：王雅（1974-），女，博士，副教授，主要從事功能食品生物工程方面的研究。

甘肅省重點培育學科資助。