亞硝酸鹽還原酶對咸魚中亞硝酸鹽的降解條件與效果研究

王雅楠，吳燕燕，任中陽，李來好，楊賢慶，周婉君

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，廣東廣州510300；2.上海海洋大學食品學院，上海201306）

亞硝酸鹽還原酶對咸魚中亞硝酸鹽的降解條件與效果研究

王雅楠1，2，吳燕燕1，任中陽1，2，李來好1，楊賢慶1，周婉君1

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，廣東廣州510300；2.上海海洋大學食品學院，上海201306）

為了探明亞硝酸鹽還原酶（Nitrite Reductase，NiRs）對咸魚中亞硝酸鹽的降解作用及應用條件，實驗以亞硝酸鹽降解量為評價指標，通過單因素實驗和Design-expert響應面實驗分析咸魚加工過程中加入亞硝酸鹽還原酶（NiRs）的酶濃度、溫度、時間的最適條件，并通過測定色差值和感官指標分析NiRs對咸魚品質的影響。結果表明：NiRs在咸魚加工中的最佳應用條件是酶濃度4mg/mL、溫度34℃、時間5h，亞硝酸鹽降解率可達到32.7%。加入NiRs不影響咸魚的品質，對咸魚風味有提升作用。研究結果表明在咸魚生產中添加NiRs可有效降解亞硝酸鹽，在保證咸魚的食用安全性的同時，為腌制水產品的加工提供理論依據和技術支撐。

咸魚，亞硝酸鹽還原酶，亞硝酸鹽，降解條件，效果

隨著微生物發酵技術的發展，產亞硝酸鹽還原酶（NiRs）的乳酸菌得以實現大量生產，從而有利于獲取NiRs，為降解腌制品以及其他食品中的亞硝酸鹽起到很大的作用［1-2］。國內外學者從多種微生物中獲取了亞硝酸鹽抑制酶［3-5］。呂玉濤等［6］對NiRs在食品中應用做了初步研究，證明NiRs在最適的反應條件下，加入到亞硝酸鹽含量超標的散裝人參蘿卜、雪里蕻、塑料包裝臘腸和臘肉中，反應12h后可以使上述腌制品的亞硝酸鹽含量降低到國家安全標準以內。Siavosh和Habibeh［7］研究發現，因亞硝酸鹽食用過量而患有胃食管反流病的患者，可通過口服NiRs降低胃部的亞硝酸鹽來減緩病情。除此之外，從蠟狀芽孢桿菌、胃幽門螺桿菌、銅綠假單胞菌［8-11］、豌豆、玉米和玉米葉［12-14］中均發現了NiRs。目前對于NiRs應用研究的食品主要為肉制品（如香腸［15］、熏肉），土豆［16］，菠菜［17-18］等。其他腌制品比如泡菜，天津冬菜［19-20］中也有初步的應用研究［21］。而有關腌制水產品方面的應用研究較少。咸魚降解亞硝酸鹽的作用主要與咸魚體內含有的乳酸菌產亞硝酸鹽還原酶有關［22-24］，本文以亞硝酸鹽降解量為評價指標，通過單因素實驗和Design-expert響應面實驗研究咸魚加工過程中加入亞硝酸鹽還原酶（NiRs）的酶濃度、溫度、時間的最適條件，并通過測定色差值和感官指標分析NiRs對咸魚品質的影響。旨為實現高效降解腌制水產品中的亞硝酸鹽，保證腌制食品的安全與人類健康，為腌制食品安全性加工提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅三魚（Red Et pisces）、白立魚（Piscibus stabit album）、藍圓鰺（Decapterus maruadsi）、三牙魚（Tres pisces dentem）、粗海鹽 均購自臺山市李貴記水產品加工廠；亞硝酸鈉（分析純） 購自天津市福晨化學試劑廠；NiRs 本實驗室從咸魚體乳酸菌中提取，純化酶活為1134.64U/mg。

UV-2550紫外-可見分光光度計 Shimadzu公司；3-18K/3K30高速臺式冷凍離心機 Sigma公司；全自動色差儀SC-80C 北京康光儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞硝酸鹽降解率的測定 亞硝酸鹽測定方法參照國標GB5009.33-2010［25］。

亞硝酸鹽降解率（%）=（M0－M1）/M0×100 式（1）

其中：M0—對照組咸魚中亞硝酸鹽含量，μg/mg；M1—實驗組咸魚中亞硝酸鹽含量，μg/mg。

1.2.2 咸魚的腌制 對照組：根據咸魚加工廠生產咸魚的方法，將冷凍海魚紅三魚、白立魚、藍圓鰺、三牙魚去除魚鱗和內臟，清洗干凈。將處理好的原料魚擺放在腌制池內加入飽和的粗鹽溶液，室溫下腌制72h，將腌制好的魚用清水沖洗，去除表面的污漬和鹽分，然后將魚擺放在曬網上晾干表面水分，再將腌魚放在熱泵干燥機中干燥，中間翻面一次，烘干溫度28℃，干燥至含水率30%左右。將干燥后的魚剪取腹部肉，去魚刺后用絞肉機絞碎。

實驗組：腌制方法同對照組，在腌制結束并清洗后，取100g左右的魚分成若干組，每組魚中加入NiRs約50m L，將酶液用注射器注入魚體，使頭部、腹部、背部、尾部均勻分布酶液，每組各做兩個平行。貼上標簽干燥至含水率30%左右。

1.2.3 NiRs在咸魚加工中的應用條件優化

1.2.3.1 NiRs濃度對亞硝酸鹽降解率的影響 在1.2.2實驗組中分別加入1、2、3、4、5mg/m L濃度的稀釋酶液。對照組不加酶液，所有樣品均在35℃條件下放置培養箱2h。每個實驗組兩個平行。測量魚肉中亞硝酸鹽含量，計算加酶后亞硝酸鹽的降解量。

1.2.3.2 不同溫度條件下NiRs對亞硝酸鹽降解率影響 在1.2.2實驗組中，加入5mg/m L等量酶液，將實驗組魚依次放入27、30、33、35、37、40℃培養箱中2h后烘干。對照組不加酶液，每個實驗組兩個平行。測量魚體亞硝酸鹽含量，計算亞硝酸鹽降解量。

1.2.3.3 不同反應時間下NiRs對亞硝酸鹽降解率影響 在1.2.2實驗組中，加入5mg/m L等量酶液，將實驗組魚放入35℃培養箱中1、2、4、8、12、24h后烘干。對照組不加酶液，每組兩個平行。測量魚體亞硝酸鹽含量，計算亞硝酸鹽降解量。

1.2.3.4 響應面法優化NiRs在咸魚工藝中的添加條件 根據單因素實驗確定的NiRs最適添加濃度、溫度和時間，運用響應面軟件design-expert設計實驗組合。因素水平設計表如表1所示。

表1 響應面因素水平設計表Table 1 Design on levels and factors of response surface

1.2.4 NiRs對咸魚品質的影響

1.2.4.1 NiRs對咸魚色差的影響 咸魚在生產過程中經過多步驟的處理加工，色差變化較大。加入NiRs后，探究咸魚的色差變化，可以了解NiRs對咸魚生產工藝的影響以及咸魚品質的影響。使用全自動色差儀記錄色差讀數，使用前用純白色和純黑色瓷磚對色差儀調零。

1.2.4.2 感官評定 由8位具有豐富食品感官品嘗經驗的人員組成感官評定小組。對傳統腌制法加工的咸魚制品和加入NiRs腌制后的咸魚制品進行外觀、氣味、咬勁、口感各方面指標的評定，評定時小組成員獨立評判，避免互相交談。每次評定一個樣品后用蒸餾水漱口，避免味覺疲勞。評分標準見表2。

表2 感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of salted fishes

1.3 數據處理

使用Design-expert對實驗結果進行方差分析，做出響應曲面圖。依照響應面分析軟件得出的最優條件組合進行驗證實驗。驗證亞硝酸鹽含量是否明顯降低。色差影響實驗中不同實驗組的色差變化，記錄數值并計算方差。感官評定實驗按照食品感官評定標準進行打分，滿分100分，計算平均值及方差。

2 結果與討論

在預實驗中除了考察NiRs的條件對咸魚色差、感官的影響，同時也考察了對咸魚水分含量、鹽度、灰分的影響。預實驗發現加入NiRs對咸魚的水分、灰分、鹽度指標無明顯影響。因此本實驗中不考慮這些因素。

2.1 NiRs在咸魚加工中的作用條件單因素實驗

2.1.1 NiRs濃度對亞硝酸鹽降解率的影響 在咸魚加工過程中，NiRs濃度增加后，NiRs活性增大，亞硝酸鹽的含量減少，亞硝酸鹽降解率增大，如圖1所示。根據實驗結果，NiRs能夠有效降低咸魚中亞硝酸鹽的含量，在濃度4～5mg/m L條件下亞硝酸鹽降解量最大。不加酶的對照組的亞硝酸鹽含量為3.688μg/g，在NiRs濃度是4mg/m L時咸魚中亞硝酸鹽含量最低為3.007μg/g，亞硝酸鹽降解率達到18.451%。

圖1 酶濃度對亞硝酸鹽降解率的影響Fig.1 Effects on nitrite degradation of different NiRs'concentrations

2.1.2 不同溫度條件下NiRs對咸魚中亞硝酸鹽降解率影響 溫度對于酶活性的影響很大，將加入等量酶液的腌制魚放入不同溫度的培養箱中，亞硝酸鹽降解率測定結果如圖2所示。NiRs對咸魚中亞硝酸鹽降解率的影響呈正態分布變化，不加酶對照組的亞硝酸鹽含量為4.329μg/g。溫度較低時酶活性受到抑制，隨著溫度增加，NiRs酶活性逐漸增大，亞硝酸鹽降解率逐漸增加。在35℃條件下亞硝酸鹽降解率達到最大，此時的亞硝酸鹽含量為3.077μg/g，亞硝酸鹽降解率達到28.912%。超過最大值后，酶活性逐漸呈下降趨勢，亞硝酸鹽降解率也逐漸減小。這是由于溫度較高時導致部分酶活性喪失。這說明溫度對于NiRs降解亞硝酸鹽的效果影響明顯。因此，亞硝酸鹽降解量最大在35℃左右，這與NiRs的最適溫度的酶學性質研究結果相同。

圖2 反應溫度對亞硝酸鹽降解率的影響Fig.2 Effects on nitrite degradation of different temperatures

2.1.3 不同反應時間下NiRs對咸魚中亞硝酸鹽降解率影響 在其他條件相同的前提下，控制咸魚加工過程中加入NiRs的反應時間，測量結果如圖3所示。不加酶對照組的亞硝酸鹽含量為4.371μg/g。隨著時間的增加，NiRs的降解效果逐漸明顯，亞硝酸鹽降解率逐漸增大。在4h時亞硝酸鹽降解率達到最大，此條件下測得的亞硝酸鹽含量為3.180μg/g，降解率達到27.241%。超過4h后，亞硝酸鹽降解率有明顯降低趨勢，可能由于溫暖的條件下長時間放置咸魚，魚體蛋白質分解又產生亞硝酸鹽，導致測得的亞硝酸鹽降解率下降。超過10h后，咸魚魚肉有明顯刺鼻氣味，超過12h以后，雖然亞硝酸鹽降解率上升，但有可能是咸魚體內細菌產酸對亞硝酸鹽進行了酸降解。由結果可知，控制NiRs反應時間4h為最佳。

圖3 反應時間對亞硝酸鹽降解率的影響Fig.3 Effects on nitrite degradation of different times

表3 響應面設計方案與實驗結果Table 3 Results of response surface

2.1.4 響應面法優化NiRs在咸魚工藝中的添加條件

根據Design-expert的中心組合實驗設計原理，綜合酶濃度、溫度和時間單因素實驗結果。以亞硝酸鹽降解率為響應值，在單因素實驗基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法。根據軟件設計的實驗組方案進行實驗后，得到NiRs降解率結果如表3所示。

根據17組實驗結果，用Design-expert軟件進行回歸擬合分析，得出三種因素變量和亞硝酸鹽降解率的關系可以用函數表示：

為了說明回歸方程的有效性，對回歸模型進行方差分析，結果如表4所示。回歸方程R2=0.987，方程的p＜0.0001，說明回歸模型極顯著。所以說這個實驗模型能可靠表示出酶濃度、酶作用溫度和酶作用時間之間的交互關系。方程失擬項為p=0.5983＞0.05，故失擬項不顯著。說明此模型擬合度好，實驗誤差較小。因此可以用該回歸方程對實驗結果進行分析。根據交互項方差分析結果來看，酶濃度與溫度的交互作用AB項的F值為9.52，p值0.0177＜0.05，這說明酶濃度與溫度交互作用對亞硝酸鹽降解量的影響顯著。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of regression equation variance

根據回歸方程方差分析結果，用Design-expert軟件分析，得到擬合響應曲面圖，如圖4～圖6所示。從圖4～圖6中可直觀看出NiRs的酶濃度、溫度、時間交互作用對亞硝酸鹽降解率的影響。由表4可知，比較F值可以看出，反應溫度對亞硝酸鹽降解率的影響比酶濃度和反應時間的影響大，相比較而言，亞硝酸鹽降解率對酶濃度變化較不敏感。影響亞硝酸鹽降解率的因素大小依次為溫度、反應時間、酶濃度。

通過Design-expert軟件分析得到，NiRs降解亞硝酸鹽的最佳優化條件是酶濃度4.1mg/m L，溫度34.4℃，時間4.7h，亞硝酸鹽降解率可達到32.799%。軟件給出的條件數值精確，在實際生產中不易操控，因此修正實驗條件為酶濃度4mg/m L，溫度34℃，時間5h，根據此條件進行驗證實驗，得到亞硝酸鹽降解率為32.7%。根據響應面所得實驗結果可知，在咸魚加工過程中加入NiRs，其酶濃度、酶反應溫度、酶反應時間均對亞硝酸鹽的最終降解率有極顯著（p＜0.01）的影響，并且酶濃度與酶反應溫度的交互作用較明顯，而酶濃度與酶反應時間，酶反應時間與酶反應溫度之間的交互作用對亞硝酸鹽降解率的影響較為不明顯。三因素最優的條件組合為酶濃度4mg/m L，溫度34℃，時間5h。

圖4 酶濃度-溫度的交互影響Fig.4 The interaction of NiRs'concentrations and temperature

圖5 酶濃度-時間的交互影響Fig.5 The interaction of NiRs'concentrations and times

圖6 溫度-時間的交互影響Fig.6 The interaction of times and temperature

目前對NiRs的應用研究較少，呂玉濤［6］對NiRs在散裝人參蘿卜、雪里蕻、塑料包裝臘腸、臘肉中的應用做了初步研究，結果顯示在加酶12h后這幾種食品的亞硝酸鹽可降低到國家規定的食品安全標準以下。鄭懷忠［26］研究NiRs在香腸中的應用，采用的原料有豬肉小香腸，雞肉香腸，伯爾尼舌腸，鄉村烤香腸，法蘭克福小香腸以及白香腸。研究結果顯示，幾組香腸的亞硝酸鹽降解率最高的是鄉村烤香腸，達到93.45%，亞硝酸鹽降解率最低的是豬肉小香腸，為72.71%。本研究證明在咸魚加工過程中加入NiRs同樣可以降解亞硝酸鹽。咸魚中的亞硝酸鹽降解率低于香腸，原因可能是香腸中的亞硝酸鹽含量本身較高，因此測出的亞硝酸鹽降解率更高，而咸魚制品中的亞硝酸鹽含量不高。香腸是肉糜，添加NiRs可以均勻作用，而咸魚本身魚體各部分就不同，不易均勻添加。除此之外，香腸原料是畜牧產品，與水產品差異較大。本實驗中由于原料的限制，加入酶液的濃度較低，可通過進一步實驗提高酶濃度增加亞硝酸鹽的降解率。

表5 NiRs對咸魚色差的影響Table 5 Effects on chromatic aberration of salted fish by NiRs

2.2 NiRs對咸魚品質的影響

2.2.1 NiRs對咸魚色差的影響 加入不同濃度的NiRs，與不加酶的對照組對比，記錄不同實驗組的色差變化，結果如表5所示，方差分析結果見表6。實驗組與對照組相比，L*，a*，b*值均略有減小。方差分析中PL、Pa、Pb均大于0.05，在0.05水平上變化均不顯著。

由于實驗組與對照組相比，色差屬于微小范圍，所以可以認為，咸魚加工過程中加入NiRs后，對咸魚制品的色差無明顯影響。

表6 咸魚色差方差分析表Table 6 Anova of chromatic aberration of salted fish

2.2.2 感官評定結果 在咸魚腌制過程中加入NiRs后進行感官評價，與傳統腌制方法加工的咸魚做對比，結果如表7所示。咸魚腌制過程中加入NiRs后，外觀、咬勁、口感和總評與傳統加工方法相比差異顯著（p＜0.05），并且比傳統腌制法得到的咸魚分值高。僅有氣味一項兩種加工方法差異不顯著（p＞0.05）。實驗說明在咸魚腌制過程中，加入NiRs可以促進咸魚中風味物質的形成，在感官上比傳統加工的咸魚有一定提升，能改善咸魚制品的風味。

表7 感官評定結果Table 7 The result of sensory valuation

3 結論

研究表明，將NiRs應用到咸魚加工生產中，可以有效降低咸魚產品亞硝酸鹽的含量，咸魚加工過程中加入NiRs，不影響咸魚產品的風味、色澤。通過對NiRs在咸魚加工中的應用條件進行研究和優化，響應面實驗分析得到生產的最佳酶作用條件為：酶濃度4mg/m L，溫度34℃，時間5h，產品中亞硝酸鹽降解率為32.7%。在腌制魚加工過程中加入NiRs可降解亞硝酸鹽，對傳統加工的咸魚和加酶加工的咸魚進行色差和感官分析，結果表明NiRs不影響咸魚的風味和色澤，并且對咸魚風味有一定的提升作用。

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Nitrite degradation conditions and effect of nitrite reductase in salted fish

WANG Ya-nan1，2，WU Yan-yan1，REN Zhong-yang1，2，LILai-hao1，YANG Xian-qing1，ZHOUW an-jun1
（1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Key Laboratory of Aquatic Product Processing of Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China；2.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China）

In order to explore application conditions on nitrate reductase，nitrite degradation was the evaluationindex. The paper analyzed the optimum conditions of nitrite reductase by single-factors and Design-expertresponse surface experiments. The impact of NiRs was analysis on quality of salted fish through color differencevalue and sensory indicators. The optimum conditions were enzyme concentration 4mg/mL，reaction temperature34℃，reaction time 5h. The degradation rate of nitrite reached 32.7％. Analysis showed that NiRs had no badeffects on the color and sensory of salted fish. NiRs had been raised the flavor of salted fish. The resultsshowed that adding NiRs to salted fish production would effectively degrade nitrite. It ensured the edible safetyof salted fish. The experiments provided theoretical basis and technical support for aquatic products processing.

salted fish；nitrite reductase；nitrite；degrade condition；effect

TS254.1

A

1002-0306（2015）08-0210-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.035

2014－06－08

王雅楠（1987-），女，碩士研究生，研究方向：水產品加工與蛋白質工程。

國家自然科學基金資助項目（31371800）；中國水產科學研究院基本科研業務費資助（2014C05XK01）；廣東省海洋漁業科技推廣專項（A201201I04，A201301C01）。