二次旋轉正交設計優化鷹嘴豆蛋白酶解工藝的研究

張繼賢，程衛東，田洪磊，詹 萍

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

二次旋轉正交設計優化鷹嘴豆蛋白酶解工藝的研究

張繼賢，程衛東，田洪磊*，詹 萍

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

實驗選用堿性蛋白酶（Alcalase）和風味蛋白酶（Flavourzyme）分步依次酶解鷹嘴豆蛋白，采用二次旋轉正交組合實驗設計對其酶解工藝進行優化。結果顯示，在初始pH8.5，初始溫度55℃，鷹嘴豆蛋白酶解的最佳工藝條件為：底物濃度1%，堿性蛋白酶的添加量為2000U/g，作用時間為2.5h，風味蛋白酶的添加量為4000U/g，作用時間為3h。在此條件下，其最大水解度可達29.17%。

二次旋轉正交組合實驗設計，鷹嘴豆，酶解

鷹嘴豆（Cicer arietium L.），一年生或多年生草本植物，適合在半干旱亞熱帶區域生長，據統計，鷹嘴豆是世界上的第二大消費豆類，其產量位居世界第三，是世界上栽培面積較大的食用豆類作物之一［1］。在我國新疆、甘肅、河北、山西等地均有栽培，其中以新疆鷹嘴豆種植面積最大、產量最高、質量最好而著稱［2］。

在新疆維吾爾族地區，由于鷹嘴豆具有諸如強壯筋骨、健胃消脾、滋潤養顏、抗HIV、抗骨質疏松等多種藥用功效，人們普遍將其視為一種營養價值較高的滋補品［3］。此外，由于鷹嘴豆蛋白的氨基酸組成均衡、生物利用率高、抗營養因子低等，同時也被視為較為重要的植物蛋白資源。目前，國內外對鷹嘴豆蛋白進行了大量的研究，主要集中在鷹嘴豆蛋白的分離純化、營養價值、功能特性等方面［4-6］。薛朝輝等［7］對鷹嘴豆蛋白進行了分類研究，發現鷹嘴豆蛋白具有較強的抗氧化活性，球蛋白活性更強，值得進一步研究。張濤等［8］對鷹嘴豆的分離特性進行了研究，發現用堿溶酸沉法提取的鷹嘴豆蛋白的純度高達91.53%，在兩個特殊點pH 5.0和離子強度0.2時，其溶解性和乳化能力都最小。馬文鵬等［9］利用堿性蛋白酶進行酶解，采用響應面法優化酶解工藝，酶解所得的水解度僅為16.18%。然而對鷹嘴豆進行雙酶酶解的研究及其酶解液進一步開發利用，目前研究相對較少。本文利用堿性蛋白酶和風味蛋白酶對鷹嘴豆蛋白進行酶解，以水解度（DH%）為指標，采用二次旋轉正交組合實驗設計優化鷹嘴豆蛋白的雙酶酶解工藝，以期最大限度提高鷹嘴豆蛋白的利用率，為鷹嘴豆蛋白的開發利用在理論上提供依據，并為后期對鷹嘴豆蛋白的深加工提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鷹嘴豆 購自新疆石河子農貿市場，用高速粉碎機將其粉碎，過80目篩，收集后以石油醚：鷹嘴豆粉2∶1（v/m）的比例，在搖床中振蕩2h，按此重復操作3次，棄去有機溶劑，進行脫脂，將脫脂后的鷹嘴豆粉置于通風廚中干燥12h，將處理好的鷹嘴豆粉裝于中型廣口瓶中置于4℃的冰箱中，保存備用［10］；堿性蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 諾維信（中國）生物技術有限公司；其他實驗試劑 均為國產分析級。

DFT-100手提式高速粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；DK-8D數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠；PHS-3C雷磁pH計 上海精科；Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機 力康發展有限公司；ZHWY-111B落地普通型大容器恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Ultrospec 5300 pro紫外可見分光光度計 上海市浦東張江高科技園區。

1.2 蛋白酶的篩選

準確稱取鷹嘴豆粉2.0g，加入蒸餾水100m L，選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶和木瓜蛋白酶在各自最適溫度和pH條件下，酶解2h，酶解完成后，在90～95℃條件下滅酶10min，冷卻至室溫，離心取其上清液，測定酶解產物的水解度和可溶性氮含量，確定最佳用酶。各種蛋白酶的酶解條件如表1所示。

表1 四種蛋白酶的酶解條件Table 1 The hydrolysis conditions of four protease

1.3 單因素實驗

1.3.1 堿性蛋白酶底物濃度 保持堿性蛋白酶的最適溫度和pH，加酶量3000U/g，反應時間2h，設底物濃度（鷹嘴豆蛋白）0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%五個水平，考察可溶性氮含量和水解度的變化趨勢。

1.3.2 堿性蛋白酶的添加量 在堿性蛋白酶最適的溫度和pH條件下，底物濃度2.0%，反應時間2h，設酶的添加量1000、1500、2000、2500、3000U/g五個水平，考察可溶性氮含量和水解度的變化趨勢。

1.3.3 堿性蛋白酶的反應時間 以堿性蛋白酶的最適溫度和pH為前提，底物濃度2.0%，酶的添加量3000U/g，設置時間變量1、2、3、4、5h五個水平，分別考察可溶性氮含量和水解度的變化趨勢。

1.3.4 風味蛋白酶的添加量 在風味蛋白酶的最適溫度和pH的條件下，底物濃度2.0%，反應時間2h，酶的添加量1000、1500、2000、2500、3000、3500U/g六個水平，考察可溶性氮和水解度的變化趨勢。

1.3.5 風味蛋白酶的反應時間 風味蛋白酶的最適溫度和pH條件下，底物濃度2.0%，酶的添加量3000U/g，設反應時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h五個水平，考察可溶性氮含量和水解度的變化趨勢。

1.4 二次旋轉正交實驗設計優化酶解條件

以單因素實驗為基礎，初始溫度55℃，初始pH 8.5，采用堿性蛋白酶和風味蛋白酶依次分步進行酶解，以水解度為指標，分別以堿性蛋白酶的添加量和作用時間、風味蛋白酶的添加量和作用時間、底物濃度為變量進行五因素二次旋轉組合實驗設計（1/2實施），共進行36組實驗，每組實驗均進行3組平行實驗進行分析驗證。因素水平編碼見表2。

表2 二次旋轉回歸正交組合實驗設計因素水平編碼表Table 2 The factors and levels of quadratic regression orthogonal rotation design

1.5 鷹嘴豆酶解工藝的流程

鷹嘴豆粉→加入適量蒸餾水→滅酶（90℃，10～15min）→用3mol/L NaOH調節pH至8.5→加入堿性蛋白酶進行酶解（55℃）→加入風味蛋白酶進行酶解（50℃）→滅酶（90℃，10～15min）→離心，取上清液。

1.6 測定指標及方法

可溶性氮含量：酶解產物上清液中總氮量與原料中總氮含量的百分比，采用微量凱氏定氮法；甲醛電位滴定法：水解度DH（%）［11］=水解液中總游離氨基酸含氮量/總氮量×100；蛋白質［12］：微量凱氏定氮法；脂肪［12］：索氏抽提法；總糖［12］：直接滴定法；水分［12］：常壓干燥法。

1.7 數據統計分析

數據采用Origin 8.0和DPS 7.05數據處理軟件進行分析處理，每組實驗的數據均進行三次平行實驗進行驗證。

2 數據處理與分析

2.1 鷹嘴豆粉成分分析

對鷹嘴豆的主要組成成分進行分析，結果如表3所示。由表3可以看出，鷹嘴豆中的蛋白質含量高達23.59%，蛋白質含量比較豐富，可利用的蛋白質較多，符合實驗用樣品的要求。

2.2 蛋白酶的篩選

根據各種蛋白酶對蛋白質酶切位點的不同，分別選取堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和中性蛋白酶四種蛋白酶，在添加相同酶活添加量（2000U/g）及其最適pH和溫度條件下對鷹嘴豆進行酶解，以DH（%）和可溶性氮含量為指標［13］，考察不同蛋白酶對鷹嘴豆蛋白酶解效果的影響，結果見圖1。

表3 鷹嘴豆粉的基本營養成分Table 3 Basic nutrition components in Chickpea flour

圖1 不同蛋白酶對鷹嘴豆粉酶解效果的影響Fig.1 Effect of different protease on enzymatic hydrolysis of Chickpea protein

由圖1可以看出，四種蛋白酶對鷹嘴豆酶解效果差異顯著（p＜0.05）。風味蛋白酶的酶解效果最好，水解度可達22.05%，其次依次為堿性蛋白酶（16.25%）、木瓜蛋白酶酶（12.77%）和中性蛋白酶（11.59%）。酶解液中可溶性氮含量的變化與相應酶酶解水解度變化趨勢大致相同，可溶性氮回收率均在53.3%～75.67%。這主要是由于不同蛋白酶對底物的酶切位點不同，所產生的酶解物中游離氨基酸種類和肽段的分子量存在較大差異，導致水解度呈現出較大的區別。本研究的目的是最大程度的利用鷹嘴豆的蛋白質資源，由于單一酶對底物的作用范圍有限，故本實驗擬采用不同性質、對鷹嘴豆蛋白有著不同切割位點的兩種酶進行雙酶酶解，以最大程度提高鷹嘴豆蛋白的水解度。前人研究發現，堿性蛋白酶酶解完成后，pH基本穩定在6.8～7.2范圍內，與風味蛋白酶的最佳酶解pH基本吻合［13］，避免了后續利用金屬鹽或緩沖溶液調節pH給產品開發帶來的安全隱患問題。因此，本實驗選用堿性蛋白酶和風味蛋白酶對鷹嘴豆粉進行雙酶酶解。

2.3 酶解單因素實驗

2.3.1 堿性蛋白酶對不同濃度的鷹嘴豆蛋白的酶解效果 在不同的底物濃度下，堿性蛋白酶對鷹嘴豆蛋白酶解水解度和可溶性氮含量的測定結果如圖2所示。

由圖2可知，不同底物濃度對鷹嘴豆蛋白水解度的影響存在顯著差異（p＜0.05）。隨著底物濃度的升高，水解度呈現先增高后降低的趨勢，當底物濃度為2%時達到最大值。當底物濃度再增加，水解度下降，這是由于底物濃度過高時，酶與底物接觸不充分［14］，不利于酶解反應的進行。底物濃度過低時，水解度過低，不利于后續產品的開發［15］。可溶性氮含量存在的顯著差異（p＜0.05），當底物濃度為1%時，可溶性氮含量較高，可能生成了許多小肽。因此，堿性蛋白酶對鷹嘴豆粉酶解的最佳底物濃度為1%～2%。

圖2 不同堿性蛋白酶底物濃度對酶解效果的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

2.3.2 堿性蛋白酶添加量對鷹嘴豆酶解效果的影響

堿性蛋白酶不同添加量對鷹嘴豆蛋白酶解效果的影響，如圖3所示。

圖3 堿性蛋白酶加酶量對鷹嘴豆酶解效果影響Fig.3 Effect of amounts of enzyme on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

由圖3可以看出，隨著酶的添加量不斷增加，水解度和可溶性氮含量均有遞增的趨勢，當增加到1500～2500U/g時，水解度呈現平緩趨勢，差異不明顯；當添加量增加到3000U/g時，水解度又有所提升，但是可溶性氮含量則呈現明顯下降趨勢。綜合考慮到成本和后續反應的進行，將堿性蛋白酶的添加量確定為1500～2500U/g。

2.3.3 堿性蛋白酶的作用時間對酶解效果的影響 堿性蛋白酶不同酶解時間對鷹嘴豆蛋白酶解效果的影響，如圖4所示。

通過圖4可知，隨著酶解時間的增加，水解度和可溶性氮含量開始均呈現上升的趨勢，不同的是，當酶解至2h之后，水解度基本處于平穩狀態，而可溶性氮含量在酶解3h之后，有下降的趨勢。綜合考慮水解度和可溶性氮含量兩個指標，最佳的酶解時間應該選擇2～3h。

圖4 酶解時間對鷹嘴豆粉酶解效果的影響Fig.4 Effect of time on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

2.3.4 風味蛋白酶的添加量對酶解效果的影響 風味蛋白酶的不同添加量對鷹嘴豆蛋白酶解效果的影響，結果如圖5所示。

圖5 風味蛋白酶的添加量對鷹嘴豆粉酶解效果的影響Fig.5 Effect of amounts of enzyme on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

由圖5可知，當風味蛋白酶不斷增加時，水解度呈現先增加后減小的趨勢，當加酶量為3000U/g時，水解度達到最大值為18.57%。雖然當加酶量達到3000U/g時，可溶性氮含量仍然處于上升的趨勢，但這時的酶解液中可能含有大量的寡肽和氨基酸，產生了一些苦味肽，不利于后續利用酶解液進行美拉德反應。因此綜合考慮，確定3000U/g為風味蛋白酶的最佳添加量。

2.3.5 風味蛋白酶酶解時間對酶解效果的影響 風味蛋白酶的不同酶解時間對鷹嘴豆蛋白酶解效果的影響，結果如圖6所示。

由圖6可以看出，隨著時間的增加，水解度和可溶性氮含量均呈現先下降后上升再下降的趨勢。當酶解時間為2h時，水解度和可溶性氮含量均達到了最大值，分別為13.93%和66.42%。所以通過兩個指標的變化趨勢，初步確定風味蛋白酶酶解鷹嘴豆蛋白較佳酶解時間為2h。

2.4 二次旋轉正交組合實驗設計結果分析

2.4.1 二次旋轉正交組合回歸方程的建立 在單因素實驗的基礎上，采用五因素二次旋轉正交組合實驗設計（1/2實施），實驗設計結果和方差分析見表4～表6。

圖6 風味蛋白酶的酶解時間對鷹嘴豆粉酶解效果的影響Fig.6 Effect of time on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

表4 二次旋轉正交組合實驗設計實驗結果Table 4 The results of Quadratic regression orthogonal rotation design

表5 回歸系數方差檢驗表Table 5 Regression coefficientof variance test results

表6 方差分析Table 6 The square－difference analysis

由表6方差分析結果可知，回歸方程的失擬性檢驗p=0.235＞0.05不顯著，從而可以認為方程合理，所選的回歸模型是適當的；回歸顯著性檢驗p=0.0001＜0.01極其顯著，說明建立的回歸模型與現實情況吻合的較好，模型成立［16］。

對回歸系數的顯著性檢驗，以下是α=0.05顯著水平剔除不顯著項后，化簡后的回歸方程：

經計算數學模型的相關系數R2=0.9334，說明在酶解實驗中的各種酶解條件下，對水解度的影響93.34%的可變性可以用此數學模型來解釋。

2.4.2 二次回歸模型單因子效應分析 采用降維分析法［17］，得出單因子變化時對水解度的影響，結果如圖7所示。

圖7 單因子效應Fig.7 The relationship of single factors to hydrolysis degree

由圖7可看出，堿性蛋白酶的添加量在-2～+2的水平上水解度先升高后降低；堿性蛋白酶的作用時間在-2～+2的水平上，先下降后升高；風味蛋白酶的添加量和酶解時間在-2～+2的水平上，水解度均呈現遞增的趨勢；而底物濃度在-2～+2的水平上，水解度呈現先降低后略微增加的趨勢。單因子的變化趨勢，與單因素實驗的變化趨勢進本吻合，說明本實驗采用二次旋轉正交組合實驗設計是合理的。

2.4.3 二次回歸模型交互作用效應分析 對上述回歸模型中具有顯著性的交互項影響可通過圖8（a～g）所示的響應面圖反映。

從圖8（a）中可以看出，提高堿性蛋白酶的添加量，水解度先呈下降后呈上升的趨勢，延長堿性蛋白酶的酶解時間則呈現先上升后下降的趨勢，兩者的交互作用變現為水解度的提高；（b）增加堿性蛋白酶的量，水解度呈上升的趨勢。隨著風味蛋白酶酶解時間的增加，水解度呈現上升后又小幅下降的趨勢，兩者的交互作用變現為水解度的下降；（c）為堿性蛋白酶的酶解時間和風味蛋白酶添加量的交互影響，增加堿性蛋白酶的酶解時間同時減少風味蛋白酶的添加量變現為提高水解度，同時減小堿性蛋白酶的作用時間同時提高風味蛋白酶的添加量也變現為水解度的提高，兩者的交互作用變現為水解度的提高；（d）為堿性蛋白酶的酶解時間和風味蛋白酶的作用時間的交互影響，在大部分范圍內，增加堿性蛋白酶的酶解時間和增加風味蛋白酶的作用時間，可以增加水解度。但兩者交互的影響為鷹嘴豆粉酶解液水解度的降低；（e）為堿性蛋白酶的酶解時間和底物濃度的交互作用，由等高線和響應面可以看出，在大部分范圍內同時減小堿性蛋白酶的酶解時間和底物濃度，可以增加水解度。兩者的交互作用影響為鷹嘴豆酶解液水解度的減小；（f）風味蛋白酶的添加量和酶解時間的交互作用，隨著酶添加量的增加，水解度有增加的趨勢，而隨著酶解時間的增加，水解度有小幅度下降的趨勢。在增加風味蛋白酶的添加量的同時，減小風味蛋白酶的作用時間，可以增大水解度。兩者的交互作用影響為水解度的提高；（g）風味蛋白酶的酶解時間和底物濃度的交互作用，隨著酶解時間和底物濃度的增加，水解度具有明顯下降的趨勢。風味蛋白酶的酶解時間和底物濃度的交互影響為水解度的降低。

2.4.4 雙酶酶解鷹嘴豆粉最佳條件的確定 用DPS軟件對五元二次旋轉正交組合實驗的結果進行分析優化，最終得出最佳的雙酶酶解條件為：堿性蛋白酶酶的添加量為2000U/g，酶解時間為2.5h；風味蛋白酶酶的添加量為4000U/g，酶解時間為3h，堿性蛋白酶的底物濃度為1%，在此條件下對鷹嘴豆粉的水解度可達到29.17%。驗證實驗所測值為（28.65%）與理論值基本一致，所以該實驗的重復性較好。

3 結論

通過二次旋轉正交組合實驗設計，建立了底物濃度和兩種酶的作用時間和酶添加量的回歸模型，選擇出雙酶酶解鷹嘴豆粉的最佳條件為：底物濃度1%，堿性蛋白酶的酶添加量2000U/g，反應時間2.5h；風味蛋白酶的酶添加量4000U/g，反應時間3h，最大水解度可達29.17%，與實驗驗證值（28.65%）基本一致，實驗的重復性良好。

圖8 雙因子交互作用的影響Fig.8 The interaction effectanalysis of two－factors to hydrolysis degree

［1］張濤，江波，王璋.鷹嘴豆營養價值及其應用［J］.糧食與油脂，2004（7）：18-20.

［2］譚永霞，孫玉華，陳若云.鷹嘴豆化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2007，32（16）：1650-1652.

［3］楊建梅，張建，余琛，等.鷹嘴豆的研究進展［J］.遼寧中醫藥大學學報，2010，12（1）：89-90.

［4］Paredes-Lopez O，Ordorica-Falomir C.Chickpea Protein isolatates：physicochemical， functional and nutritional characterization［J］.Journal of Food Science，1991，56（3）：726-729.

［5］Snchez-Vioque R，Clemenet A，Vioque J，et al.Protein isolates from Chickpea（Cicer arietinum L.）：Chemical composition，functional properties and protein characterization［J］. Food Chemistry，1999（64）：237-243.

［6］Ganesh KK，Venkataraman LV.Chickpea seed proteins：isolation and characterization of10.protein［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1980（28）：524-529.

［7］薛朝輝，劉珊娜，李勇，等.鷹嘴豆蛋白的制備及抗氧化活性［J］.中國油脂，2008，33（8）：24-26.

［8］張濤，江波，王璋.鷹嘴豆分離蛋白質的特性［J］.食品與生物技術學報，2005，24（3）：66-69.

［9］馬文鵬，傅力.響應面分析法優化鷹嘴豆多肽的酶法提取工藝［J］.中國調味品，2011，36（11）：29-32.

［10］周麗卿.鷹嘴豆多肽的制備及改性研究［D］.咸陽：西北農林科技大學，2012（5）：12-15.

［11］Eremeev NL，Nikolaev IV，Keruchen'ko ID，etal.Enzymatic hydrolysis of keratin containing stock for obtaining protein hydrolysates［J］.Applied Biochemistry and Microbiology，2009，45（6）：648-655.

［12］AOAC.Official methods of analysis（16th ed）［S］.Washington DC：Association of Offical Analytical Chemists，2002.

［13］詹萍，張曉鳴，田洪磊.二次旋轉正交組合設計優化羊骨蛋白酶解工藝［J］.食品工業科技，2013，33（19）：182-186.

［14］Nilsang S，Lertsiri S，Suphantharika M，et al.Optimization of enzymatic hydrolysis of fish soluble concentrate by commercial proteases［J］.Journal of Food Engineering，2005，70（4）：571-578.

［15］Ovissipour M，Abedian A，Motamedzadegan A，et al.The effect of enzymatic hydrolysis time and temperature on the properties of protein hydrolysates from persian sturgeon（Acipenser persicus）viscera［J］.Food Chemistry，2009，115（1）：238-242.

［16］唐啟義，馮明光.實用統計分析及其數據處理系統［M］.北京：科學出版社，2002：159-163.

［17］曲曉婷，張名位，溫其標，等.二次通用旋轉組合設計法優化米糠蛋白提取工藝［J］.食品研究與開發，2007，28（1）：102-106.

Optimizing enzymatic hydrolysis conditions of Chickpea flour through quadratic orthogonal rotation combination design

ZHANG Ji-xian，CHENG Wei-dong，TIAN Hong-lei*，ZHAN Ping
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi832000，China）

The Chickpea flour was hydrolyzed with Alacalase and Flavourzyme，and the quadratic regression orthogonal rotary combination design was used to improve the op timization of hydrolysis conditions of Chickpea protein.The results showed that when the initial pH was 8.5 and the temperature was 55℃，the best processing conditions of Chickpea protein enzymolysis were as follows:the substrate concentration 1%，the Alcalase dosage 2000U/g with 2.5h，the adding content of flavourzyme was 4000U/g with 3h.Based on these conditions，the maximum deg ree of hydrolysis could reach 29.17%.

quadratic orthogonaldesign；Chickpea flour；enzymolysis

TS255

A

1002-0306（2015）08-0196-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.032

2014－07－07

張繼賢（1989－），男，在讀碩士研究生，研究方向：食品風味化學。

*通訊作者：田洪磊（1979－），男，博士，副教授，研究方向：功能食品與配料。

兵團興邊富民科技專項（2012BA068）。