基于ITS和IGS1序列分析對云南牛肝菌的分類鑒定

岳萬松，熊 勇，王燕彩，陳毅堅，2，*

（1.云南民族大學化學與生物技術學院，云南昆明650500；2.國家民委-教育部共建民族藥資源化學重點實驗室，云南昆明650500；3.昆明理工大學環境科學與工程學院，云南昆明650500）

基于ITS和IGS1序列分析對云南牛肝菌的分類鑒定

岳萬松1，熊 勇1，王燕彩3，陳毅堅1，2，*

（1.云南民族大學化學與生物技術學院，云南昆明650500；2.國家民委-教育部共建民族藥資源化學重點實驗室，云南昆明650500；3.昆明理工大學環境科學與工程學院，云南昆明650500）

以采自云南地區的5個牛肝菌（Boletus sp.）樣品為材料，根據樣品的形態特征，并結合rDNA ITS和IGS1序列分析對5個樣品進行分類鑒定，通過與GenBank上已登錄的牛肝菌序列比對，采用鄰接法（neighbor-joining，N-J）構建系統發育樹。結果表明，所有供試材料的ITS和IGS1全長分別在739～787bp和537～583bp范圍內，GC含量分別在48.31%～51.01%和48.42%～52.89%之間，遺傳距離在0.017～0.248和0.002～0.225之間，上述數據表明云南5個牛肝菌樣品之間存在一定的遺傳差異。5個牛肝菌樣品的ITS和IGS1序列聚類分析均表明，供試樣品被分為兩大類，其中樣品YX1-2和QJ3-4聚為一個類群，樣品CX2-10、QJ3-5和YX1-3聚為另一個大的類群，兩種分析手段相互印證，且ITS序列聚類分析能將云南不同地點的牛肝菌鑒定到屬甚至種的水平，上述分析結果表明ITS和IGS1序列分析相結合可作為牛肝菌親緣關系鑒定的有效分子標記方法。

牛肝菌，ITS序列，IGS1序列，分子鑒定

野生牛肝菌（Natural Boletus sp.），又名大腳菇，隸屬于真菌門，擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，牛肝菌科，牛肝菌屬［1］，是世界珍貴的一類食藥兼用的食用菌。主要分布在我國西南和華南地區及東北和華東沿海各省，云南是全球野生食用菌最為豐富的地區之一，尤其是牛肝菌資源［2］。野生牛肝菌富含多種氨基酸、活性多糖、蛋白質和維生素等多種營養成分［3］，其子實體具有提高人體免疫力、降血脂、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤及抗氧化等藥理作用［4-8］。

由于牛肝菌物種多樣性豐富，種間形態相似性高，形態學鑒定相對較困難，各種牛肝菌所含成分有差異，有的甚至含有毒素，但普通民眾一般是“以貌擇食”的方式來選擇食用牛肝菌，因此常有食用牛肝菌中毒的事件發生。因此，探索新的方法來鑒定商品牛肝菌中的混淆毒菌很有必要。

隨著分子生物學的快速發展，基因序列分析對比成為了現實，對真核生物rDNA的研究中，基于ITS序列分析鑒定食用菌的技術已被廣泛應用［9-11］，此外，由于IGS區變異相對較快，且各重復單位間具有同步進化的特點，因此也常用于種間、種內、近緣類群、雜交類群等關系的研究［12］。在食用菌的研究中，已有研究者對香菇（Lentinus edodes）和白靈側耳（Pleurotus nebrodensis）商業栽培菌株的IGS1和IGS2區域進行研究，表明這些食用菌種內菌株間IGS序列存在顯著的差異［13-14］。但是以IGS序列堿基差異分析牛肝菌種內的遺傳多樣性及系統演化關系的報道較少見。

本研究用PCR方法擴增云南5個牛肝菌樣品的rDNA ITS和IGS1序列分析序列并測序，利用生物信息技術對測序結果分析比較，揭示牛肝菌系統發育關系，旨在為研究牛肝菌的系統演化規律以及品種間親緣關系提供一些新的分子生物學資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肝菌 實驗用5個新鮮牛肝菌子實體樣品，均于2013年8～9月分別購自云南省玉溪市、曲靖市和楚雄市集貿市場，新鮮子實體用保鮮袋包裝帶回實驗室，根據形態特征進行初步分類（表1），表1中5個樣品形態特征的初步分離鑒定參考《中國大型真菌》［15］和《云南牛肝菌圖志》［16］；引物LR12R、M-1和DNA MarKer北京博邁德生物；2×Power Taq PCR Master Mix

表1 供試牛肝菌樣品及來源Table 1 Tested strains of Boletus and origins

北京百泰克；

Eppedorf 5331 PCR儀 德國；GENE GENIUS凝膠成像系統 美國；DYY-GB電泳儀、DYCP-31DN電泳槽 北京六一。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 牛肝菌總DNA提取方法參照CTAB-SDS法［17-18］并加以改良，即醇析DNA時，使用2倍上清液體積的異丙醇要先在-20℃預冷，并同時加入1/10倍上清液體積的3mol/L KAc（pH 8.0），然后在4℃冰箱放置15m in來加速絮狀DNA的沉淀。用瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA質量。

1.2.2 PCR擴增、測序 IGS1通用引物（LR12R：5'-CTGAACGCCTCTAAGTCAGAA-3'；M-1：5'-AACC ACAGCACCCAGGATTCCC-3'）［19］，ITS通用引物（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）［20］，2個序列PCR擴增共用同一個50μL反應體系，體系包括：25μL 2×Power Taq PCR M ixture，引物各2μL，5μL DNA模板，16μL ddH2O；ITS反應條件：預變性94℃ 5min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，35次循環，72℃10m in，4℃保存；IGS1反應條件：預變性94℃5m in，94℃30s，56℃30s，72℃30s，35次循環，72℃10m in，4℃保存。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用Bio-Rad凝膠成像系統觀察結果。

1.2.3 PCR產物的純化、測序及系統發育樹的構建PCR產物用多功能DNA純化回收試劑盒回收，送昆明碩陽科技有限公司測序，測序結果DNAMAN進行拼接，將得到的序列提交GenBank數據庫，并通過在線Blast工具從NCBI下載GenBank等數據庫內已知同源序列多條作為參考序列。用MEGA 5.1軟件包進行系統發育分析和系統發育樹的構建。用MEGA 5.1中的Kimura-2-parameter模式計算遺傳距離，所有對位排列結果中的空位或缺失數據作完全刪除處理，采用鄰接法（neighbor-joining，N-J）構建聚類圖，系統樹的每個分支的統計學顯著性分析以Bootstrap方法進行檢驗，重復次數為1000次。

2 結果與分析

2.1 5個牛肝菌樣品IGS1和ITS序列PCR擴增結果

從圖1和圖2可見，5個牛肝菌樣品IGS1序列長度約在500～700bp之間，ITS序列長度約在700～900bp之間，PCR產物均出現清晰明顯的條帶，說明實驗所提的DNA質量較好。

2.2 5個牛肝菌樣品IGS1和ITS序列的差異性分析

通過DNAMAN和MEGA 5.1對不同牛肝菌樣品測序結果分析，5個牛肝菌樣品YX1-2（白牛肝，玉溪易門）、YX1-3（紅見手青，玉溪易門）、QJ3-4（白牛肝，曲靖瀟湘）、QJ3-5（紅見手青，曲靖馬龍）和CX2-10（風手青，楚雄紫溪山）的IGS1序列長度為537～583bp，兩端切平后長度為537bp，GC含量為48.42%～52.89%，ITS序列長度為739～787bp，兩端切平后長度739bp，GC含量為48.31%～51.01%（見表2）。

圖1 5個牛肝菌IGS1-PCR擴增電泳圖Fig.1 Amplification profile of electrophoretogram IGS1-PCR of 5 boletus

圖2 5個牛肝菌ITS-PCR擴增電泳圖Fig.2 Amplification profile of electrophoretogram ITS-PCR of 5 boletus

表2 牛肝菌rDNA IGS1和ITS序列的長度和GC含量Table 2 Length and GC contents of Boletus rDNA IGS1 and ITS sequences

分析5個牛肝菌IGS1序列長度，結果表明，YX1-2和CX2-10的IGS1序列長度差異最大（46bp），YX1-2和CX2-10的GC含量差異也最大（4.47%），表明牛肝菌屬不同種的IGS1序列的長度和GC含量存在較大差異，而樣品YX1-3和QJ3-5的IGS1序列不僅長度相同（均為541bp），而且GC含量也相同（均為51.21%），說明二者是屬內親緣關系很近的種，YX1-2和QJ3-4的GC含量差異也較小（0.56%），二者親緣關系也較近。

分析5個牛肝菌ITS序列長度，結果表明，YX1-2和CX2-10序列長度差異最大（48bp）。YX1-2和QJ3-5的GC含量差異最大（2.7%），YX1-3和QJ3-5的GC含量差異最小（0.13%），說明二者是牛肝菌屬內親緣關系較近的種，YX1-2和QJ3-4的GC含量差異也是0.13%，二者同樣是親緣關系較近的種。這樣也與牛肝菌不同種IGS1序列的分析結果基本吻合，說明采用IGS1和ITS序列分析相結合的分析手段對食用牛肝菌分類鑒定是可行的，而且可以相互印證，分析結果更加準確有效。

2.3 5個牛肝菌樣品的遺傳多樣性分析

不同牛肝菌樣品間rDNA ITS和IGS1序列的遺傳距離及序列距離矩陣構建采用MEGA5.1軟件中的Kimura-2-parameter模型進行計算（見表3和表4）。

表3 不同牛肝菌IGS1序列的遺傳距離Table 3 Genetic distance among different kinds of Boletus IGS1 Sequence

分析表3結果表明，5個牛肝菌樣品YX1-2（白牛肝，玉溪易門）、YX1-3（紅見手青，玉溪易門）、QJ3-4（白牛肝，曲靖瀟湘）、QJ3-5（紅見手青，曲靖馬龍）和CX2-10（風手青，楚雄紫溪山）的IGS1序列間的遺傳距離為0.002～0.225，平均0.145。其中，CX2-10與QJ3-4遺傳距離最大為0.225，二者親緣關系最遠；其次，QJ3-5與QJ3-4，遺傳距離為0.212；YX1-3和QJ3-5遺傳距離最小為0.002，二者親緣關系最近；另外，YX1-2與QJ3-4的遺傳距離也較小（0.029），說明二者也是牛肝菌屬內親緣關系較近的兩個種。

表4 不同牛肝菌ITS序列的遺傳距離Table 4 Genetic distance among different strains of Boletus ITSSequence

分析表4結果表明，5個牛肝菌樣品YX1-2（白牛肝，玉溪易門）、YX1-3（紅見手青，玉溪易門）、QJ3-4（白牛肝，曲靖瀟湘）、QJ3-5（紅見手青，曲靖馬龍）和CX2-10（風手青，楚雄紫溪山）的ITS序列間的遺傳距離為0.017～0.248，平均0.180。其中，CX2-10與YX1-2遺傳距離最大為0.248，二者親緣關系最遠；其次，CX2-10與QJ3-4的遺傳距離為0.236；YX1-3和QJ3-5遺傳距離最小為0.017，二者親緣關系最近；另外，YX1-2與QJ3-4的遺傳距離也較小（0.033），說明二者也是牛肝菌屬中親緣關系較近的種。采用ITS標記對云南不同牛肝菌樣品遺傳距離和親緣關系的分析結果與IGS1標記的分析結果基本吻合，上述結果表明IGS1和ITS序列分析相結合可以更準確有效的分析牛肝菌屬內不同種的親緣關系。

2.4 5個牛肝菌樣品的系統進化樹分析

通過在線Blast工具從NCBI數據庫內下載已知的多條相似序列作為參考序列，比較它們的相似性，以NCBI中香菇的IGS1序列和ITS序列為聚類外群，用MEGA 5.1中的Kimura-2-parameter（K2P）模型，采用N-J法對不同牛肝菌進行分析并構建遺傳關系樹，自舉檢測1000次（見圖3和圖4）。

圖3 基于IGS1序列構建的NJ系統發育樹Fig.3 NJPhylogenetic tree based on IGS1 sequences

IGS1序列聚類分析結果表明，云南不同地點的5個牛肝菌樣品YX1-2（白牛肝，玉溪易門）、YX1-3（紅見手青，玉溪易門）、QJ3-4（白牛肝，曲靖瀟湘）、QJ3-5（紅見手青，曲靖馬龍）和CX2-10（風手青，楚雄紫溪山）分為2個類群。YX1-2和QJ3-4聚為一個類群，自檢支持率為100%，雖然兩者生長環境不同但親緣關系很近，Blast比對結果表明，二者與NCBI庫里的Boletus edulis、Boletus pinetorum和Boletus pinophlis菌株聚在一個大支上，但是YX1-2和QJ3-4與它們的相似性都低于95%，不能鑒定為屬內同一品種。CX2-10、QJ3-5和YX1-3聚為另一個大的類群，自檢支持率為99%，且QJ3-5和YX1-3聚在一個小的分支上，兩者生長環境的不同但親緣關系也很近，但是在NCBI庫里沒有找到與3個云南牛肝菌相似性比較高的菌株，不能確定三個樣品的種屬歸類。

圖4 基于ITS序列構建的NJ系統發育樹Fig.4 NJPhylogenetic tree based on ITSsequences

ITS序列聚類分析結果表明，云南不同地點的5個牛肝菌樣品YX1-2（白牛肝，玉溪易門）、YX1-3（紅見手青，玉溪易門）、QJ3-4（白牛肝，曲靖瀟湘）、QJ3-5（紅見手青，曲靖馬龍）和CX2-10（風手青，楚雄紫溪山）分為2個類群。YX1-2和QJ3-4與NCBI庫里的Boletus edulis（美味牛肝菌）、Boletus aestivalis（夏牛肝菌）和Boletus reticulatus（網柄牛肝菌）等菌株聚在同一分支，形成自檢支持率為100%的廣義美味牛肝菌復合群，且Blast比對結果表明，QJ3-4與庫里的Boletus edulis GQ984158、Boletus aestivalis DQ131611和Boletus reticulatus AB821462等廣義美味牛肝菌的序列相似度都為99%，可以將QJ3-4與上述菌株同歸為廣義美味牛肝菌，YX1-2與庫里相似性最高的菌株是Boletus edulis EF646278，為97%，表明二者是牛肝菌屬內親緣較近的種。CX2-10、QJ3-5和YX1-3聚為另一個大的類群，其中YX1-3和QJ3-5與NCBI庫里的Boletus magnificus DQ407260聚在一個小支上，自檢支持率為100%，且Blast比對結果表明，YX1-3和Boletus magnificus DQ407260的相似性高達99%，鑒定為Boletus magnificus（華麗牛肝菌），QJ3-5與它的相似性為98%，可以確定QJ3-5菌株是牛肝菌屬內與Boletus magnificus親緣關系很相近的種，CX2-10與NCBI庫里的Boletus speciosus JN903703和Boletus speciosus JN903701相似性分別為98%和97%，三者聚在大類群中是一個小分支上，自檢支持率為100%，表明CX2-10是牛肝菌屬中與Boletus speciosus（小美牛肝菌）親緣關系很近的種。

3 結論與討論

通過傳統的分類學手段，對云南不同地點的5個牛肝菌樣品進行了初步分類鑒定（見表1），并結合ITS和IGS1序列分析對不同菌株進行系統發育分析，結果表明，將QJ3-4鑒定為廣義美味牛肝菌，YX1-3鑒定為Boletusmagnificus（華麗牛肝菌）。此外，YX1-2和Boletus edulis EF646278（美味牛肝菌）相似性為97%，QJ3-5和Boletus magnificus DQ407260（華麗牛肝菌）相似性為98%，CX2-10和Boletus speciosus JN903703（小美牛肝菌）的相似性分為98%，雖然不能將它們與NCBI庫里的菌種歸為同一個種，但是可以確定它們是牛肝菌屬內親緣關系較近的種。

云南特殊的生境資源，孕育了豐富的大型真菌資源，生態復雜使得云南牛肝菌生物多樣性豐富，種間形態相似性較高，通過傳統的生物學手段難以鑒定大型真菌，因此需要采用形態學并結合分子生物學手段對其進行鑒定，近年來，ITS標記都具有快速、準確、標準化、引物通用性強、擴增成功率高、便于高通量測序與分析等優點，因此被廣泛應于真菌系統發育、種間和種內遺傳多樣性的研究［21-23］，由于IGS區變異相對較快，且各重復單位間具有同步進化的特點，因此也常用于種間、種內、近緣類群、雜交類群等關系的研究，但是相關報道較少，目前，只見IGS標記應用于香菇和白靈側耳等少數食用真菌的遺傳多樣性研究中［13-14］。

本文的研究結果表明，ITS序列聚類分析能將云南不同產地的牛肝菌鑒定到屬甚至種的水平，表明ITS序列分析是牛肝菌分離鑒定的有效分子手段之一，且本研究采用的IGS1序列聚類分析與ITS序列聚類分析結果基本一致，二個聚類發育樹都將云南不同地點的5個牛肝菌樣品分為兩個類群。兩種分析手段相互印證，使分析結果更加準確有效，所以ITS和IGS1序列分析相結合可作為牛肝菌親緣關系鑒定的有效分子標記方法。

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Molecular identification of different Boletus in Yunnan based on ITS and IGS1 sequence analysis

YUEW an-song1，XIONG Yong1，WANG Yan-cai3，CHEN Yi-jian1，2，*
（1.School of Chemistry and Bio-technology，Yunnan Minzu University，Kunming 650500，China；2.Key Lab of National Medicine Supported Jointly by State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Kunming 650500，China；3.School of Environmental Sciences and Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

The morphyological characters of five kinds of Boletus in Yunnan were observed，and their rDNA ITSand IGS1 sequences of were measured，analysed and contrasted with the sequences of Boletus having beenlogged in GenBank. Phylogenetic tree was constructed by the obtained molecular data. The results showedthat the total length of all the tested material ITS and IGS1 was respectively within the scope of 739～787bp and537～538bp. the content of GC was respectively within the scope of 48.31％～51.01％ and 48.42％～52.89％，therange of genetic distances was respectively between 0.017～0.248 and 0.002～0.225. The datas showed thatthere was certain genetic differences between five kinds of Boletus. The five kinds of Boletus could be dividedinto two groups by their ITS and IGS1 sequence clustering analysis，YX1-2 and QJ3-4 formed in one group，CX2-10，QJ3-5 and YX1-3 formed into another group，two analytical methods confirm each other，and fivesamples from different regions of Yunnan were identified to genus level and even species based on the ITSsequence clustering analysis，it showed that combining the ITS with IGS1 sequences could effectively identifythe genetic relationship of Boletus.

Boletus；Internal transcribed spacer；Intergenic spacer 1；molecular identification

TS201.1

A

1002-0306（2015）08-0186-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.030

2014－07－07

岳萬松（1990-），男，碩士研究生，研究方向：食用菌資源開發和利用。

*通訊作者：陳毅堅（1966-），女，博士，教授，研究方向：民族藥資源開發和利用。

云南民族大學教育部民委共建重點實驗室開放基金項目（MZY1104）；云南省生物技術實驗示范中心建設項目（0205-2001015209）；云南民族大學生物技術核心教學團隊項目（0205-02010008）。