應用三種方法觀察副溶血性弧菌生物被膜

藍 英，郭卓然，付嬌嬌，潘迎捷，2，3，趙 勇，2，3，*

（1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海201306；3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306）

應用三種方法觀察副溶血性弧菌生物被膜

藍 英1，郭卓然1，付嬌嬌1，潘迎捷1，2，3，趙 勇1，2，3，*

（1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海201306；3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306）

采用三種方法（結晶紫染色法、熒光顯微鏡法、掃描電鏡法）觀察了兩株分離自食品中的副溶血性弧菌Vp8和Vp32在4℃條件下的生物被膜形成情況，旨在為進一步研究低溫條件下副溶血性弧菌生物被膜提供依據。結果表明：三種觀察方法所得結果基本一致，Vp8有大量生物被膜形成，而Vp32幾乎沒有生物被膜形成。結論：在副溶血性弧菌生物被膜的研究中，各種觀察方法各有利弊，可根據不同實驗室條件或不同研究需求選擇合適的觀察方法。

副溶血性弧菌，生物被膜，結晶紫染色，熒光顯微鏡，掃描電鏡

細菌生物被膜（Bacterial biofilm）是指單一或多種細菌為適應周圍環境，附著于載體（塑料、金屬、醫療植入材料和人體組織等）的表面，由細菌及其自身分泌的聚合性含水基質包裹而形成的聚集物，其主要成分包括多糖基質、纖維蛋白、脂蛋白、胞外DNA等。生物被膜中的細菌對各種物理、化學、生物學的應激反應均不敏感，尤其對抗菌類藥物的敏感性顯著降低［1-3］。由于生物被膜中的細菌可以抵抗宿主免疫應答，較浮游態細菌對抗生素耐藥性更強（達到1000倍），這就使得常規的殺菌方法不能有效滅菌，并且從生物被膜中分離出來的細胞將進一步轉變為持續污染源，因而由細菌生物被膜引起的污染尤其難治［4-5］。副溶血性弧菌是一種廣泛存在于海水，海底沉積物以及魚、蝦、貝等海產品中的常見革蘭氏陰性嗜鹽細菌［6］，是海水養殖中的一種重要的條件致病菌，也是我國沿海地區食物中毒和夏季腹瀉的重要病原，已經高居微生物性食物中毒首位［7-8］。選擇適宜觀察方法評估副溶血性弧菌生物被膜形成能力對有效控制和清除食品加工過程中的副溶血性生物被膜污染具有重要意義。目前生物被膜的常用觀察方法主要有剛果紅實驗、結晶紫染色法、銀染法、熒光顯微鏡、掃描電鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡法等，均為表性檢查方法［9］。

本文采用三種方法（結晶紫染色法、熒光顯微鏡法、掃描電鏡法）觀察了兩株副溶血性弧菌在4℃條件下的生物被膜形成情況，從準確性、靈敏度、成本及檢測速度等方面比較了三種方法的優缺點，以期為副溶血性弧菌生物被膜的研究提供一定的方法依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副溶血性弧菌菌株來源及基因型見表1。

表1 副溶血性弧菌菌株來源及基因型Table 1 The source and genotype of vibrio parahaemolyticus

乙醇 上海展云化工有限公司，分析純；氯化鈉 上海生工生物工程有限公司，分析純；胰蛋白胨大豆肉湯培養基 TSB，北京陸橋技術有限責任公司。

24孔板、96孔板 上海生物工程有限公司；BioTek多功能酶標儀 基因有限公司；搖床 江蘇環宇科學儀器廠；熒光顯微鏡 卡爾蔡司有限公司；掃描電鏡 日本株式會社日立制作所。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液的獲得 將副溶血性弧菌接種于含5m L TSB［含3%（W/V）NaCl，下同］的試管中，37℃、180r/min搖床培養10h，連續活化2次，至OD600=0.6，作為種子液。

1.2.2 菌液制備 將所得種子液用TSB按1∶100的比例進行稀釋，取1m L稀釋后的菌液置于24孔板中37℃培養24h，隨后移至4℃靜置貯藏24h。

1.2.3 結晶紫染色 將1.2.2中24孔板取出，移除菌液，加入1.5m L 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=8.0）清洗兩次，去除浮游菌體。加入1m L 0.1%（W/V）的結晶紫染液在室溫下染色30min，吸水紙吸掉染料后，再用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，將其置于60℃烘箱中干燥30min，然后加入1m L 95%乙醇，檢測其在570nm條件下的吸光值（OD570）［10-11］。以新鮮TSB培養基為陰性對照，每個實驗重復三次。

1.2.4 熒光顯微鏡 將24孔板取出，移除菌液，加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，去除懸浮的菌體。用4%（v/v）戊二醛磷酸鹽緩沖液在4℃條件下固定2h，加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，用SYBR GreenⅠ（1∶100000）染色30m in。再用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，制作成載玻片置于熒光顯微鏡下觀察細菌生物被膜形成情況［12］。

1.2.5 掃描電鏡 將24孔板取出，移除菌液，加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，去除浮游菌體。加入2.5%（v/v）戊二醛磷酸鹽緩沖液置于4℃靜置過夜，再用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，每次10m in。然后樣品用1%鋨酸室溫下固定1h，固定完成后用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，每次10m in。然后分別用30%、50%、70%和90%乙醇脫水10min，100%乙醇脫水三次，每次10m in，樣品用乙酸異戊酯處理兩次，每次15min。將脫水樣品在臨界點干燥器干燥5h后噴金，掃描電鏡下觀察副溶血性弧菌生物被膜形成情況［13］。

1.3 數據處理與分析

結晶紫染色數據處理與分析：以新鮮TSB培養基所測得的OD值作為對照，以該值的兩倍（ODc）為臨界值，將菌株被膜的形成分為以下4類：強生物被膜形成OD＞4ODc，中等被膜形成2ODc＜OD≤4ODc，弱生物被膜形成ODc＜OD≤2ODc和無生物被膜形成OD≤ODc［8］。

2 結果與討論

2.1 結晶紫染色法觀察副溶血性弧菌生物被膜形成狀況

采用結晶紫染色方法檢測Vp8和Vp32在4℃靜置貯藏24h后的生物被膜形成情況，以570nm條件下吸光度值的高低表示被膜形成量的多少。結果如表2所示，以新鮮TSB培養基測得的OD570值0.09作為對照，ODc為0.18。由表2可知，Vp8的OD570是ODc的19.65倍，因而可以判定Vp8為強生物被膜形成；Vp32的OD570＜ODc，因而可以判定Vp32無生物被膜形成。實驗結果表明在相同條件下，不同的菌株有不同的生物被膜形成情況。李燕等［9］對臨床分離的45株表皮葡萄球菌采用結晶紫染色法進行檢測，發現有18株有生物被膜形成，其余27株無生物被膜形成。生物被膜的形成是一個復雜耗時的多基因調控、多因子參與的過程，已有研究表明aphA對副溶血性弧菌生物被膜的形成有影響［14］。

利用生物被膜內物質可以與結晶紫染料結合的特點，可以通過染色的方法對生物被膜進行定性或定量的分析。如果過程中著色較深說明生物被膜形成比較成熟，如果著色較淺則說明生物被膜基本沒有形成或牢固度不夠。結晶紫染色法簡單、快捷、價格低廉、對實驗條件要求較低，可用于實驗室對生物被膜形成能力的半定量研究。但結晶紫染色法操作費力，難于標準化，此外，該方法只測量了細菌生物量而不是生物被膜的細胞活力［15］。已有不同的研究表明清洗條件（步驟、自動化、水、磷酸緩沖液等），結晶紫的持續時間，結晶紫濃度等都會對結果造成顯著影響［16-17］。

表2 副溶血性弧菌Vp8和Vp32在4℃靜置貯藏24h后OD570Table 2 The OD570of Vp8 and Vp32 under 4℃for 24h

2.2 熒光顯微鏡法觀察副溶血性弧菌生物被膜形成狀況

熒光顯微鏡法用SYBR GreenⅠ對生物被膜進行染色，觀察Vp8和Vp32在4℃靜置貯藏24h后的生物被膜形成情況。由圖1可知，Vp8形成了典型的多細胞聚集的生物被膜結構，該結構覆蓋了材料表面的大部分，熒光強度較強。而Vp32則呈單細胞分布，并沒有形成明顯的細菌聚集，熒光強度也較弱。由熒光顯微鏡觀察結果可知：Vp8有大量生物被膜形成，而Vp32則無生物被膜形成。此方法觀察結果與結晶紫染色法所得結果一致。SYBR GreenⅠ會與生物被膜內物質結合，結合后其熒光信號會大大增強，可判斷物體的形狀及其所在位置。

熒光顯微鏡法對實驗條件要求較低，價格較低廉，耗時較短，可觀察到細菌大量聚集在一起，但不能進行定量檢測，可用于實驗室對生物被膜形態的初步觀察。在染色的過程中生物被膜會受到染色試劑的影響，其結構形態可能會發生不同程度的改變。另外熒光顯微鏡法只能初步觀察細菌生物被膜的表層現象，無法對被膜內層結構和生理學現象進行觀察［18］

圖1 Vp8和Vp32生物被膜熒光顯微鏡圖片（×400）Fig.1 The fluorescencemicroscope images of biofilms of Vp8 and Vp32（×400）

2.3 掃描電鏡法觀察副溶血性弧菌生物被膜形成狀況

圖2為采用掃描電鏡法觀察Vp8和Vp32在4℃靜置貯藏24h后的被膜形成情況。由圖2可知，Vp8大量聚集在一起且被胞外聚合物包圍，細菌嵌入生物被膜內部，菌體表面有隆起和凹陷，形成明顯的皺褶，在微菌落中，細菌與細菌間有絲狀連接；Vp32在相同條件下幾乎無細菌聚集體及胞外聚合物的形成。由掃描電鏡結果可知：Vp8有大量生物被膜形成，Vp32無生物被膜形成。該方法所得結果與前兩種方法結果相一致。

圖2 Vp8和Vp32生物被膜掃描電鏡圖片Fig.2 The scanning electronmicroscope images of biofilms of Vp8 and Vp32

掃描電鏡是一種定性觀察微生物的方法，由于掃描倍數高，成像清晰，立體感強，可以清晰地觀察到生物被膜內存在細菌聚集成團的現象，且細胞間有纖維樣連結。因此，該法可很好的用于生物被膜形態學方面的鑒定，其結果更準確、可靠，被認為是檢測生物膜形成能力的“金標準”，適用于高靈敏度觀察的實驗［19］。但掃描電鏡法耗時長，對實驗條件要求高，也不能進行定量檢測，且在操作中需要固定及脫水處理，容易破壞生物被膜的結構引起實驗假象，且價格昂貴，難以滿足實驗室對生物膜形成能力的評估要求，不宜做常規檢測。

3 結論

生物被膜的形成是細菌為適應自然環境而采取的策略，任何細菌在成熟條件下都可以形成生物被膜［20］。本文分別比較研究了結晶紫染色法、熒光顯微鏡法和掃描電鏡法三種不同的方法觀察副溶血性弧菌生物被膜形成情況。三種觀察方法所得結果一致：Vp8有大量生物被膜形成，Vp32幾乎無生物被膜形成。

總之，副溶血性弧菌生物被膜形成能力的觀察對有效控制和清除食品加工過程中的副溶血性生物被膜污染具有重要意義。隨著對生物被膜研究的不斷深入，用于細菌生物被膜形成能力的檢測方法種類會越來越多，但如何提高細菌生物被膜的檢測水平，建立快速、靈敏、準確的檢測方法，并且研制出簡便、特異的檢測試劑盒應用于生產，將會是今后研究的重要內容。

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Applied three methods to observe biofilms of Vibrio parahaemolyticus

LAN Ying1，GUO Zhuo-ran1，FU Jiao-jiao1，PAN Ying-jie1，2，3，ZHAO Yong1，2，3，*
（1.College of Food Science and Technology，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China；2.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation，Shanghai201306，China；3.Laboratory of Quality＆Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation（Shanghai），Ministry of Agriculture，Shanghai201306，China）

Methods（crystalviolet staining，fluorescence microscope，scanning electron microscope）were app lied to observe biofilms of Vibrio parahae molyticus（Vp8 and Vp32）at4℃，in order to lay a foundation for the further study of Vibrio parahaemolyticus under the condition of low temperature.The results showed that Vp8 could be considered as strong biofilm producers while Vp32 was negative.Conclusion:Each method had its advantages and disadvantages，thus an appropriate method could be selected depending on the condition of laboratory or the study demanding.

vibrio parahaemolyticu；biofilm；crystal violet staining；fluorescence microscope；scanning electron microscope

TS201.3

A

1002-0306（2015）08-0183-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.029

2014－07－15

藍英（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全。

*通訊作者：趙勇（1975-），男，博士，教授，研究方向：食品安全。

國家自然科學基金面上項目（31271870）；上海市科委計劃項目（14DZ1205100，14320502100，12391901300）；上海市科技興農重點攻關項目（滬農科攻字2014第3-5號）。