澄清劑對黃酒混濁蛋白去除效果的研究

樊世英，孫軍勇，謝廣發(fā)，陸 健，5，*

（1.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122；3.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；4.中國紹興黃酒集團有限公司國家黃酒工程技術研究中心，浙江紹興312000；5.宿遷市江南大學產(chǎn)業(yè)技術研究院，江蘇宿遷223800）

澄清劑對黃酒混濁蛋白去除效果的研究

樊世英1，2，3，孫軍勇1，2，3，謝廣發(fā)3，4，陸 健1，2，3，5，*

（1.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122；3.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；4.中國紹興黃酒集團有限公司國家黃酒工程技術研究中心，浙江紹興312000；5.宿遷市江南大學產(chǎn)業(yè)技術研究院，江蘇宿遷223800）

研究了單寧、硅膠和PolyclarRBrewbrite等澄清劑對黃酒混濁蛋白特異性去除的效果，并通過采用N-三（羥甲基）甘氨酸-十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、基質輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質譜，研究了黃酒混濁蛋白及不同澄清劑吸附蛋白的分子量、蛋白質種類及來源，并比較了澄清劑處理前后酒樣隆丁區(qū)分和非生物穩(wěn)定性的變化。結果表明：黃酒混濁蛋白的主要成分為類燕麥蛋白和二聚α-淀粉酶抑制劑，主要來源于小麥，幾種澄清劑對二聚α-淀粉酶抑制劑都有一定的吸附作用，且處理后的酒樣穩(wěn)定性得到提高，其中以單寧效果最為明顯。

黃酒，澄清劑，混濁蛋白，基質輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質譜，蛋白穩(wěn)定性

黃酒是一種成分復雜、營養(yǎng)豐富的膠體溶液，含有蛋白質、氨基酸、多酚、糖、金屬離子等物質。在存儲的過程中，黃酒受到光照、振動、氧氣的影響，膠體平衡被打破而出現(xiàn)失光、絮凝和沉淀［1］。在黃酒的沉淀物中，蛋白質占有較大的比例，一般在30%～50%，并且在沉淀蛋白中高分子蛋白質含量都高于50%［2-5］。因此，一些研究者認為黃酒中高分子蛋白質含量高是引起黃酒非生物穩(wěn)定性差的原因。然而，有的研究者認為盡管高分子蛋白質在沉淀中所占的比例大，但黃酒的穩(wěn)定性并不隨著黃酒中高分子蛋白質含量增高而降低，而可能與黃酒中某類容易形成混濁的蛋白質有關［6］。

提高黃酒穩(wěn)定性的研究早有報道，研究者通過物理法冷凍、微濾、超濾技術去除黃酒中的部分蛋白質或使其凝聚析出，或者用化學的方法向黃酒中添加澄清劑，如單寧、植酸、PVPP、殼聚糖、膨潤土等［7-10］，減少黃酒中蛋白質或多酚的含量，都取得了一些成果。目前，國內的幾家大型黃酒生產(chǎn)企業(yè)都采用了冷凍過濾的工藝來解決黃酒的穩(wěn)定性問題，但是冷凍處理對混濁蛋白的選擇性并不是十分理想，且存在能耗高的問題。因此，對黃酒的混濁蛋白成分進行分析，加強此類蛋白質的研究并特異性的去除該類蛋白，將是提高黃酒蛋白穩(wěn)定性的最佳途徑。

為了解決這一問題，本文比較了幾種澄清劑對黃酒混濁蛋白的去除效果，研究了與混濁形成相關指標的變化。并且通過SDS-PAGE確定黃酒沉淀中蛋白質分子量的分布，利用基質輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質譜（MALDI-TOF/TOF MS）技術分析其成分及來源，為在工業(yè)化生產(chǎn)中控制黃酒的蛋白穩(wěn)定性提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃酒 浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供的未經(jīng)穩(wěn)定處理的花雕酒；硅膠1 美國PQ公司；硅膠2 Stabiquick系列硅膠，德國Stabifix公司；五倍子單寧 鄭州隴海啤酒物資專營店；PolyclarRBrewbrite 美國國際特品公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（APS）、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250 上海生工進口分裝產(chǎn)品；Tricine和蛋白質標準品（分子量4.1～45.0ku） 上海生工生物工程公司；NH4HCO3、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、三氟乙酸（TFA） 美國Sigma公司；其他試劑 均為分析純。

蛋白電泳系統(tǒng)（M ini-Protein 3 Cell） 美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機 美國Sigma公司；Ultraflextreme串聯(lián)飛行時間質譜儀 德國Bruker公司；UV-2100紫外可見分光光度計 尤尼克上海儀器公司；WGZ-2-PJ濁度計 上海昕瑞儀器儀表有限公司；K2300凱氏定氮儀 丹麥Foss有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酒混濁蛋白樣品制備 取500m L酒樣，自然存放一段時間，直至出現(xiàn)混濁沉淀，離心收集沉淀物，再將沉淀物懸浮于超純水，離心（12000r/m in，30m in），重復上述過程，收集沉淀，超純水洗滌2次，用2%氨水溶解，用80%飽和硫酸銨鹽析，然后用3000u的透析袋于4℃下脫鹽48h，冷凍干燥，即得到混濁蛋白樣品［11］。

1.2.2 澄清劑吸附蛋白質樣品制取［11］向澄清酒樣中分別添加單寧（70mg/L）、硅膠1、2（500mg/L）、PolyclarRBrewbrite（200mg/L），離心收集沉淀，用2%氨水溶解后，離心除去硅膠和PolyclarRBrewbrite，回收上清液，向上清液中緩慢添加硫酸銨使其相對飽和度達到80%，混合攪拌形成沉淀，離心收集沉淀后，透析脫鹽，冷凍干燥得到澄清劑吸附蛋白樣品。

1.2.3 Tricine-SDS-PAGE電泳 將混濁蛋白和澄清劑吸附蛋白溶于0.05mol/L Tris中，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。凝膠配制參考曹佐武的實驗方法［12］。電泳結束后將凝膠在含有50%乙醇和10%冰醋酸的固定液中固定0.5h后，在考馬斯亮藍R-250染色液中染色3h，然后用含10%甲醇和10%冰醋酸的脫色液脫色至背景清晰，電泳圖譜用JD-801凝膠成像儀記錄，通過捷達801圖像分析軟件3.3分析。

1.2.4 MALDI-TOF/TOF MS 切取凝膠上可見的蛋白條帶，加入200μL的100mmol/L碳酸氫銨/30%乙腈（V/V），振蕩脫至無色，加入50μL無水乙腈脫水2次，得白色膠粒。每管加入5μL胰蛋白酶液，置于4℃冰箱中30～60min，使膠粒完全吸收酶液，吸出多余酶液，加入20μL 25mmol/L碳酸氫銨溶液，37℃水浴20h。將酶解液吸出加入到新離心管中，將酶解液和萃取液旋轉真空濃縮，加入TA60溶液3μL振蕩復溶。吸取0.7μL樣品點樣，晾干后加0.7μL基質，干燥后運用質譜儀對樣品進行肽質量指紋圖譜分析。一級質譜數(shù)據(jù)采集模式采用正離子反射模式與自動獲取數(shù)據(jù)模式，掃描范圍為700～3500u。選取5～10個信號強度較好的一級質譜峰進行二級質譜分析，使用BioTools軟件進行整合，Mascot軟件用于質譜數(shù)據(jù)搜索，搜索數(shù)據(jù)庫為NCBI，物種屬為全物種，切割酶為胰酶［13］。

1.2.5 總氮及隆丁區(qū)分的測定 參照文獻［14］測定。

1.2.6 穩(wěn)定性實驗

1.2.6.1 熱處理實驗 根據(jù)Juinn-Chin Hsu［15］的方法稍作修改，取澄清劑處理前與處理后的酒樣各50m L，90℃水浴6h，冷卻至室溫，分別測定熱處理前后的濁度，計算濁度增加量。

1.2.6.2 乙醇-濁度實驗 取澄清劑處理前與處理后的酒樣各50m L，加入25m L無水乙醇，振蕩混勻，2h后測濁度，計算酒精添加前后濁度增加量［16］。

1.2.6.3 強制老化實驗 取澄清劑處理前與處理后的酒樣各50m L，0℃放置12h；80℃，12h為一個循環(huán)，三個循環(huán)后冷卻至室溫測濁度并計算濁度變化量［13］。

1.2.7 氨基酸態(tài)氮、酒精度、pH、總酸、總糖含量測定 參照文獻［17］測定。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE及質譜鑒定結果與分析

采用Tricine-SDS-PAGE凝膠方法來分離混濁蛋白，將混濁蛋白及澄清劑吸附的蛋白按照1.2.3的方法進行電泳，結果見圖1。

通過凝膠分析軟件計算圖1中各條帶的積分光密度及分子量，可知混濁蛋白主要分布在大約14.9ku和32.5ku處，而各種澄清劑吸附蛋白也位于這兩處，由此可見，幾種澄清劑對混濁蛋白都有一定的吸附作用。對明顯的條帶取點進行質譜鑒定，鑒定結果見表1。條帶a1～a5為類燕麥蛋白，主要來源于小麥，條帶b1～b5鑒定結果為二聚α-淀粉酶抑制劑，同樣來源于小麥，而這兩種蛋白也存在于啤酒的混濁蛋白中［18］。類燕麥蛋白是小麥中的儲藏蛋白，主要存在于小麥胚乳中，屬于低分子量谷蛋白，含有一定數(shù)量的半胱氨酸，分子內和分子間存在的二硫鍵可以形成高分子聚合體［19］，影響混濁物的形成。α-淀粉酶抑制劑是普遍存在于植物種子中的一種酶抑制劑，在小麥種子中主要存在12、24、60ku 3種形式，單體的α-淀粉酶抑制劑分子量為12、24、60ku分別為二聚體和四聚體，分解后單體的分子量在13ku左右［20-21］。α-淀粉酶抑制劑可以抑制內生性淀粉酶的活性，使攝入體內的淀粉不能水解，阻斷主要的能量來源，從而可以防御昆蟲的侵害，并且在治療糖尿病和高血糖方面有重要作用［22-23］。研究發(fā)現(xiàn)［21］，α-淀粉酶抑制劑具有較好的酸堿耐受性，在pH4～11時蛋白性質結構穩(wěn)定，在70℃作用30m in后酶活基本沒有變化，80℃作用10min活性僅降低10%左右。據(jù)此分析，在黃酒煎酒的過程中，其熱穩(wěn)定性好，只有少部分的α-淀粉酶抑制劑失活變性凝固析出，大部分還存在于酒液中，經(jīng)過長時間的貯存，外界環(huán)境發(fā)生變化，導致其逐漸析出形成混濁。除此之外，α-淀粉酶抑制劑可以與α-淀粉酶形成可溶性的復合體，從而使淀粉酶失去活性，降低對淀粉的分解能力，導致淀粉分解不徹底，部分糊精［5］會殘留在酒液中，隨著環(huán)境變化糊精會析出，加重黃酒的非生物混濁。

圖1 混濁蛋白及澄清劑吸附蛋白Tricine-SDS-PAGE電泳圖Fig.1 Tricine-SDS-PAGE electrophoresis of the proteins in haze and absorbed by fining agents

表1 蛋白質質譜鑒定結果Table 1 Results of proteins identification by MALDI-TOF/TOFMS

2.2 澄清劑處理對黃酒蛋白穩(wěn)定性的影響

2.2.1 澄清劑處理前后總氮及隆丁區(qū)分的變化 隆丁區(qū)分可以反映黃酒中不同分子量段的蛋白質的組成比例。從表2分析出，未經(jīng)澄清劑處理的酒樣中，總氮含量最高。經(jīng)過澄清劑處理后，一部分蛋白被吸附，酒體中總氮含量有所下降，但下降幅度不大，保留了原酒樣中97%以上的蛋白。然而，酒樣中高、中、低分子蛋白質的組成比例變化較大。其中，經(jīng)過單寧和PolyclarRBrewbrite處理后，酒樣的中分子蛋白分別減少了12.1%和19.6%，而低分子氮的含量變化并不明顯，這說明澄清劑對酒體中的蛋白質是具有選擇性的吸附，對高、中分子蛋白質具有一定的吸附效果，并且PolyclarRBrewbrite對中分子氮的吸附量大于對高分子氮的吸附量。由圖1可知，處于中分子氮范圍內的13ku左右的α-淀粉酶抑制劑和32.4ku左右的類燕麥蛋白是混濁蛋白的主要成分，因此，中分子蛋白質含量的減少有利于黃酒穩(wěn)定性的提高。

表2 澄清劑處理前后總氮及隆丁區(qū)分變化Table 2 Total nitrogen and Lundin fraction of the rice wine before and after fining

2.2.2 穩(wěn)定性實驗 采用熱處理法、乙醇-濁度法和強制老化法綜合評價澄清劑處理前后的蛋白穩(wěn)定性，結果如表3所示。澄清劑處理后，黃酒的非生物穩(wěn)定性得到提高，其中以單寧處理過的酒樣效果尤為明顯，90℃水浴6h后濁度僅增加了1.92NTU，遠遠低于未進行穩(wěn)定處理酒樣增加的濁度（9.72NTU），而兩種硅膠和PolyclarRBrewbrite處理過的酒樣熱穩(wěn)定性提高幅度不大。乙醇-濁度法是通過加入乙醇，破壞黃酒中的蛋白質與多酚結合形成的動態(tài)平衡，使酒體的濁度產(chǎn)生變化，加入相同量的乙醇時，濁度變化大則穩(wěn)定性差，反之亦然，是一種快速預測黃酒穩(wěn)定性的新方法。向澄清劑處理前后的酒樣中添加50%的乙醇，測其濁度變化，澄清劑處理后的酒樣濁度增加量都低于原酒樣，其中，單寧和硅膠2處理過的酒樣濁度增加量較小。強制老化則是通過高低溫交替存放，促進黃酒中混濁的形成，相當于快速的自然存放。強制老化3個循環(huán)后，酒樣的濁度增加，單寧處理過的酒樣濁度增加量最小。

表3 穩(wěn)定性實驗Table 3 Stabilization treatment

2.2.3 總酸、總糖、氨基酸態(tài)氮及酒精度的變化 由2.2.2的穩(wěn)定性實驗可知，單寧對于提高黃酒的穩(wěn)定性有相當明顯的效果。對單寧處理前后的酒樣按照國家標準GB/T 13662-2008進行常規(guī)指標測定。結果如表4所示，單寧處理后，酒體中氨基酸態(tài)氮含量有顯著（p＜0.05）差異，而總糖、酒精度、總酸及pH等基本不變，且以上指標均符合國家標準。

表4 單寧處理對黃酒常規(guī)理化指標的影響Table 4 Specifications of Chinese rice wine before and after tannin treatment

3 結論

通過對黃酒混濁的蛋白質成分進行分析，發(fā)現(xiàn)黃酒混濁蛋白主要分布于13ku和32.4ku，這與先前研究者認為混濁蛋白主要是高分子蛋白的結果不同［2，5］。應用MALDI-TOF/TOF MS技術鑒定出這兩個條帶的蛋白質分別為類燕麥蛋白和二聚α-淀粉酶抑制劑，理論等電點處于5.58～8.03之間，均來源于小麥。

各種澄清劑對黃酒的這兩種混濁蛋白都有一定的吸附能力，經(jīng)過澄清劑處理后的黃酒穩(wěn)定性得到了不同程度的提高，其中，單寧的效果優(yōu)于其他幾種澄清劑，且保持了酒樣原有的品質。

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Study on fining agents on removing the haze protein in Chinese rice wine

FAN Shi-ying1，2，3，SUN Jun-yong1，2，3，XIE Guang-fa3，4，LU Jian1，2，3，5，*
（1.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；3.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；4.National Engineering Research Center for Chinese RiceWine，China Shaoxing Rice Wine Group Co.，Ltd，Shaoxing 312000，China；5.Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian，Suqian 223800，China）

The tannin，silica and PolyclarR Brewbrite were used to remove haze protein in Chinese rice wine. Themolecular weight of protein in the haze was investigated by Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis（Tricine-SDS-PAGE）. The proteins in the haze of Chinese rice wine and absorbed by finingagent were identified by matrix - assisted laser desorption ionisation - time of flight / time of flight massspectrometry（MALDI-TOF/TOF MS）. Lundin fraction and colloidal stability of Chinese rice wines before andafter fining were analyzed. The results showed that the main components of haze protein in Chinese rice winewere avenin-like protein and dimer α-amylase inhibitor，deriving from the Triticum aestivum. All of the finingagents were able to absorb the haze protein and improve the colloidal stability of Chinese rice wine，especiallythe tannin.

Chinese rice wine；fining agent；haze protein；MALDI-TOF/TOFMS；colloidal stability

TS201.1

A

1002-0306（2015）08-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.025

2014－07－01

樊世英（1990-），女，碩士研究生，主要從事釀酒方面的研究。

*通訊作者：陸健（1968-），男，教授，研究方向：釀酒科學與工程。

973項目（2012CB720802）；973項目（2013CB733602）；安全食品精深加工科技創(chuàng)新平臺建設（2012B091400030）；國家自然科學基金重點項目（31130043）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目；高等學校學科創(chuàng)新引智計劃（111計劃）資助項目（111-2-06）。