儲藏微環境下玉米谷蛋白的SDS-PAGE電泳分析

王若蘭，田曉花，趙 妍

（河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450001）

儲藏微環境下玉米谷蛋白的SDS-PAGE電泳分析

王若蘭，田曉花，趙 妍*

（河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450001）

通過SDS-PAGE電泳技術，分析不同品種的玉米在不同溫濕度微環境下儲藏60d和120d谷蛋白的變化，并運用Bandscan3.0軟件對電泳圖譜進行分析處理，探究玉米谷蛋白的變化規律。結果表明：隨著儲藏時間的延長，玉米谷蛋白中大分子量亞基的含量下降，小分子量亞基的含量上升；不同儲藏微環境下的溫濕度會影響玉米谷蛋白亞基變化，低溫低濕條件下亞基分子量變化幅度小，而隨著溫濕度的上升，大分子量亞基含量逐漸下降，小分子量亞基含量逐漸增加。對比四種儲藏微環境，在15℃和50%RH的條件下，谷蛋白亞基的變化最小，最有利于玉米品質的保持。

玉米谷蛋白，SDS-PAGE電泳，儲藏微環境

玉米是當今重要的糧食作物之一，隨著畜牧業和加工業對其需求的逐年增加，玉米將成為未來保障我國糧食安全的關鍵作物。蛋白質作為玉米重要的營養成分之一，其亞基的組成對于蛋白質的功能和營養特性影響較大［1-3］。玉米谷蛋白占玉米蛋白含量的20%～28%，富含酰胺基氨基酸，其中的谷氨酰胺占氨基酸總量的1/3［4］，谷氨酰胺有維持腸胃正常代謝和提高免疫力的功能，同時可以作為膳食補充劑和靜脈營養劑［5］，因此玉米谷蛋白作為天然的食品營養劑在食品和醫藥領域潛力巨大。

儲糧生態系統中糧食籽粒在生物因子與非生物因子作用下，進行微弱的代謝作用。與其他谷物相比，玉米原始水分含量高、胚部巨大使其具有較強的生命活動和較高的呼吸強度［6］，因此玉米的儲藏穩定性較差，同時儲藏微環境中不同的溫濕度將進一步影響玉米籽粒的代謝活動。蛋白質是玉米籽粒的重要營養物質，其變化規律受儲藏溫濕度微環境的影響，目前對于蛋白質變化規律的研究常采用SDS-PAGE分析方法。SDS-PAGE對于蛋白質的量化、比較、鑒定具有快速、經濟、重復性好的特點［7-8］，SDSPAGE圖譜分析已廣泛地用于品種鑒定、種子純度檢驗、親緣關系鑒定等研究。目前對于儲藏期間玉米谷蛋白變化的研究較少，本文以我國七大儲糧區域的溫濕度為劃分依據，模擬了不同生態區的儲藏微環境，運用SDS-PAGE對儲藏期間谷蛋白的變化進行分析。探究玉米在儲藏期間蛋白質變化的規律不僅對安全儲糧有一定借鑒意義，同時對于玉米谷蛋白的深度加工和利用，具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所用玉米 2013年購買于河南瑞星種業有限公司，品種為先玉335、鄭單958（2013年收獲）；氯化鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、過硫酸銨（AP）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、巰基乙醇、甘油、蔗糖、溴酚藍、鹽酸、甘氨酸、考馬斯亮藍R-250、甲醇、冰乙酸、低分子量標準蛋白 以上試劑均為分析純；水 均為重蒸水。

DYCZ-24DN型電泳儀、DYY-6C電泳儀電源 北京六一儀器廠；GL-20G-II型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；THZ-82型水浴恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；STS-2A型脫色搖床 上海琪特分析儀器有限公司；PHS-3C型精密酸度計 上海大普儀器有限公司；HWS智能型恒溫恒濕箱 寧波江南儀器廠；JA2003A電子天平 上海精天電子儀器廠；JFSD-70實驗室粉碎磨 上海嘉定糧油儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗條件和樣品處理 根據生態儲糧區域的不同，我國劃分為七大儲糧區域，依據玉米主要產區的位置實驗條件選擇以東北儲糧區、華北儲糧區、華中儲糧區和華南儲糧區的年平均溫濕度條件作為代表，設計了A：15℃，50%RH；B：20℃，65%RH；C：28℃，75%RH；D：35℃，85%RH四種微環境條件，并在恒溫恒濕箱中進行人工模擬儲藏，其中A、B、C、D四種微環境分別屬于低溫儲藏、準低溫儲藏、常溫儲藏和高溫儲藏的范圍，具有代表性，儲藏時間為120d，每60d取A、B、C、D處理組玉米樣品用實驗室粉碎磨在960r/m in的轉速下磨成粉末（每組樣品需粉碎3次，每次的粉碎時間為10s），過60目的篩網，裝自封袋備用。

1.2.2 谷蛋白質提取 參照文獻［9-10］的方法，并對其進行改進。稱取2g處理后樣品置于10m L的離心管中，按照1∶1.5的比例加蒸餾水并攪拌均勻，在水浴振蕩器上振蕩30min（220r/min），5000r/min離心10min，得到沉淀I；按照1∶1.5的比例在沉淀I中加入10%的氯化鈉溶液，重復上述步驟得沉淀II；然后按照1∶1的比例在沉淀II中加入70%的乙醇溶液并攪拌均勻，在水浴振蕩器上振蕩1h（220r/min），5000r/min離心10min，得到沉淀III；按照1∶1的比例在沉淀III中加入0.2%的氫氧化鈉溶液并攪拌均勻，在水浴振蕩器上振蕩1h（220r/m in），5000r/m in離心10m in，上清液置-20℃貯存（7d備用），供電泳分析。

1.2.3 電泳條件 采用垂直板SDS-PAGE凝膠電泳［11-12］并選取合適的條件，樣品緩沖液為0.01mol/L pH8.0 Tis-HCI緩沖液、2%SDS、5%巰基乙醇、40%蔗糖及0.02%溴酚藍；分離膠與濃縮膠濃度分別為濃度12%與5%；電極緩沖溶液為0.1%SDS，0.05mol/L Tris-0.384mol/L甘氨酸緩沖液，pH為8.3；制膠厚度為1.0mm，進樣量為15μm。

凝膠電泳開始時電流為15mA，待樣品進入到分離膠，電流調節至35mA。當溴酚藍指示劑距玻璃板下沿0.5cm時，關閉電源。待電泳結束后用考馬斯亮藍法進行染色2～10h，蒸餾水沖洗干凈后加入脫色液置于脫色搖床上進行脫色，數小時可換一次脫色液，直至背景清晰，進行成像。

1.3 電泳圖譜處理

采用Bandscan 3.0軟件對電泳圖譜進行分析處理。

2 結果與分析

圖1 原始樣品的谷蛋白電泳圖譜Fig.1 Glutelin electrophoretogram patterns for the originnal sample

圖2 不同微環境條件下儲藏60d的谷蛋白電泳圖譜Fig.2 Glutelin electrophoretogram patterns for the sample which were stored 60d under different micro-environmental conditions

圖1～圖3分別為先玉335和鄭單958原始樣品以及在不同儲藏微環境下儲藏60d和120d的谷蛋白電泳圖譜。

圖3 不同微環境條件下儲藏120d的先玉335和鄭單958的谷蛋白電泳圖譜Fig.3 Glutelin electrophoretogram patterns for the sample of Xianyu 335 and Zhengdan 958 which were stored 120d under different micro-environmental conditions

通過Bandscan 3.0軟件對電泳圖譜進行分析處理得出如下結果（見表1～表5），其中表1為兩種玉米原始樣品的谷蛋白亞基分子量與百分比；表2、表4分別為先玉335在不同微環境下儲藏60d和120d的谷蛋白亞基分子量和百分比；表3、表5分別為鄭單958在不同微環境下儲藏60d和120d的谷蛋白亞基分子量和百分比。

表1 兩種玉米原始樣品的谷蛋白亞基分子量與百分比Table 1 Themolecularweight and percentage of gluten subunit for the two originalmaize samples

表2 先玉335在不同微環境下儲藏60d后的谷蛋白亞基分子量和百分比Table 2 The molecular weight and percentage of gluten subunit for the Xianyu 335 which was stored 60d under different micro-environmental conditions

表3 鄭單958在不同微環境下儲藏60d后的谷蛋白亞基分子量和百分比Table 3 The molecular weight and percentage of gluten subunit for the Zhengdan 958 which was stored 60d under different micro-environmental conditions

在4種微環境下儲藏60d的先玉335玉米與其原始樣品相比，谷蛋白組成發生了變化，主要體現在蛋白質亞基的分子量和所占百分比上，在儲藏期間伴隨著高分子量谷蛋白亞基的分解和低分子量谷蛋白亞基的積累，其中分子量小于16ku的亞基變化較為明顯。由表1和表2可知：4種儲藏微環境條件下（15℃和50%RH、20℃和65%RH、28℃和75%RH、35℃和85%RH）分子量為72ku的谷蛋白亞基條帶消失，而在60～70ku之間出現了新的亞基條帶；分子量小于16ku的谷蛋白亞基所占百分比與原始樣品相比分別增加了0.0%、12.8%、13.4%和34.6%。由表2和表4可知：在4種微環境下儲藏120d的玉米與儲藏60d的玉米相比，其谷蛋白主要亞基的分子量進一步減小，在15℃和50%RH、20℃和65%RH、28℃和75%RH、35℃和75%RH 4種條件下分子量小于16ku的谷蛋白亞基所占百分比分別增加了9.5%、2.8%、9.0%和6.6%。

表4 先玉335在不同微環境下儲藏120d后的谷蛋白亞基分子量和百分比Table 4 The molecular weight and percentage of gluten subunit for the Xianyu 335 which was stored 120d under differentmicroenvironmental conditions

表5 鄭單958在不同微環境下儲藏120d后的谷蛋白亞基分子量和百分比Table 5 The molecular weight and percentage of gluten subunit for the Zhengdan 958 which was stored 120d under different microenvironmental conditions

在4種微環境下儲藏60d的鄭單958玉米與其原始樣品相比，谷蛋白亞基分子量及百分比的變化如表1和表3所示：在4種儲藏微環境條件下（15℃和50% RH、20℃和65%RH、28℃和75%RH、35℃和85%RH）分子量為70ku的谷蛋白亞基條帶消失，而在65～70ku之間出現了新的條帶；分子量小于16ku的谷蛋白亞基所占百分比與原始樣品相比分別增加了0.0%、12.8%、31.2%和34.3%。由表3和表5可知：在4種微環境下儲藏120d的玉米與儲藏60d的玉米相比，其谷蛋白主要亞基的分子量進一步減小，15℃和50%RH、20℃和65%RH、28℃和75%RH、35℃和75%RH 4種條件下分子量小于16ku的谷蛋白亞基所占百分比分別增加了0.0%、18.3%、2.1%和13.6%。

通過對2種玉米樣品在不同儲藏溫濕度微環境下的谷蛋白變化規律進行分析，其結果表明：在儲藏期間，分子量高于70ku的谷蛋白逐漸降解，而小分子量蛋白逐漸積累；隨著儲藏時間的延長，2種玉米樣品的谷蛋白亞基分子量均存在一定程度的減小；在不同的儲藏微環境條件下谷蛋白亞基分子量的減小程度與儲藏溫度和濕度有關，15℃和50%RH條件下的亞基分子量變化范圍最小，而35℃和85%RH條件下的亞基分子量變化范圍最大。玉米谷蛋白亞基的變化可能是由蛋白質的降解引起的，有研究表明植物蛋白質降解與肽鏈內切酶的活性相關［13-14］，玉米籽粒中富含水解酶和氧化還原酶，儲藏過程中，適宜的溫度和濕度會使酶活力大大增強，從而加速玉米谷蛋白的降解。張進忠等［15］研究發現小麥儲藏一段時間后，低分子量麥谷蛋白減少，高分子量麥谷蛋白增加，與本文中玉米谷蛋白的變化不一致，其原因可能為與小麥相比，玉米具有含水量高、呼吸強度大的特點，且胚部含有大量蛋白質，促進了蛋白質的降解，而小麥經過后熟作用又合成了一定量的麥谷蛋白，導致了高分子量麥谷蛋白的增加。

3 結論

整體而言，不同儲藏微環境條件下，隨著儲藏時間的延長兩種玉米樣品谷蛋白中大分子量亞基含量下降，而小分子量亞基含量升高。溫度和濕度對玉米谷蛋白的影響，表現為低溫低濕條件下亞基分子量和亞基含量變化幅度較小，而隨著溫濕度的上升，大分子量亞基含量逐漸減小，小分子量亞基含量逐漸增加。對比四種儲藏微環境，在15℃和50%RH的條件下，谷蛋白亞基組成變化最小，最有利于玉米品質的保持。

［1］王顯生，麻浩，向世鵬，等.不同SDS-PAGE分離膠濃度條件下大豆貯藏蛋白亞基的分辨效果［J］.中國油料作物學報，2004，26（2）：75-80.

［2］YagasakiK，Kousaka F，Kitamura K.Potential improvement of soymilk gelation and properties by using soybeans with modified protein subunit compositions［J］.Japan J Breeding，2000，50：101-107.

［3］Adriana Q，María E，Javier S，et al.Rheological and thermal properties ofmasa as related to changes in corn protein during nixtamalization［J］.Journal of Cereal Science，2011，53：139-147.

［4］沈蓓英.玉米蛋白深層次發［J］.糧食與油脂，1998（3）：39-40.

［5］WongW，Magnuson A，Nakagawa K，et al.Oral subchronic and genotoxicity studies conducted with the amino acid，L-glutamine［J］.Food and Chemical Toxicology，2011，49：2096-2102.

［6］王若蘭.糧油儲藏學［M］.北京：中國輕工業出版社，2009：311-314.

［7］陳毓荃.生物化學實驗方法與技術［M］.北京：科學出版社，2002：16-21.

［8］曲樂慶，佐藤光，小川雅廣，等.水稻種子貯藏谷蛋白的改良電泳分析法（英文）［J］.遺傳學報，2001，28（8）：730-737.

［9］何范照.糧油籽粒品質及其分析技術［M］.北京：中國農業出版社，1985：57-59.

［10］張智猛，戴良香，胡昌浩，等.氮素對不同類型玉米籽粒氨基酸、蛋白質含量及其組分變化的影響［J］.西北植物學報，2005，25（7）：1415-1420.

［11］應天翼.蛋白質組學實驗技術精編［M］.北京：化學工業出版社，2010：39-47.

［12］郭堯君.蛋白質電泳實驗技術［M］.北京：科學出版社，2004：92-106.

［13］Beers E P，Woffenden B J，Zhao C S.Plant proteolytic enzymes：possible roles during programmed cell death［J］.Plant Molecular Biology，2000，44：399-415.

［14］Dominguez F，Cejudo F J.Pattern of end oproteolysis following wheatgrain germination［J］.Physiologia Plantarum，1995，95：253-259.

［15］張進忠，王金水，周長智，等.不同儲藏條件下小麥蛋白質變化研究［J］.鄭州糧食學院學報，1997，18（4）：72-76.

SDS-PAGE electrophoresis analysis of corn gluten under storage microenvironment

WANG Ruo-lan，TIAN Xiao-hua，ZHAO Yan*
（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

The change of corn gluten in different varieties was analyzed by SDS-PAGE electrophoresis technique. Corn was stored for 60d and 120d under storage microenvironment with different temperature and humidity，and Bandscan 3.0 software was used to analyze the electrophoresis patterns and exp lore the variation of corn gluten.Experimental results showed that:with the extension of storage time，the proportion of high molecular weight subunit declined in corn gluten，and the proportion of low molecular weight subunit increased.Under different storage microenvironment，the changes of corn gluten were effected by temperature and humidity. Subunit molecular varied slightly with low temperature and humidity.With the rising of temperature and humidity，the proportion of high molecular weight subunit decreased gradually，and the proportion of low molecular weight subunit increased.Compared the four storage microenvironment，the variation of corn gluten subunit was the most least under the condition of 15℃ and 50%RH.Hence，15℃ and 50%RH was most suitable to maintaining the quality of corn.

corn gluten；SDS-PAGE electrophoresis；storage microenvironment

TS210.2

A

1002-0306（2015）08-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.024

2014－07－02

王若蘭（1960-），女，碩士，教授，研究方向：農產品加工與儲藏。

*通訊作者：趙妍（1982-），女，博士，講師，研究方向：農產品采后保鮮與儲藏。

國家高技術研究發展計劃（863計劃）（2012AA101705-2）；河南省教育廳自然科學項目（13B550956）；河南工業大學高層次人才基金（2011BS016）。