酶法酯交換制備塑性脂肪工藝優化及氧化穩定性研究

張超然，李 楊，孫曉洋，王勝男，齊寶坤，李 丹，馬文君，江連洲，*，隋曉楠

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.諾維信（中國）山東創新與發展中心，山東濟南250101）

酶法酯交換制備塑性脂肪工藝優化及氧化穩定性研究

張超然1，李 楊1，孫曉洋2，王勝男1，齊寶坤1，李 丹1，馬文君1，江連洲1，*，隋曉楠1

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.諾維信（中國）山東創新與發展中心，山東濟南250101）

以棕櫚硬脂、油茶籽油及棕櫚仁油為原料，利用酶法酯交換制備塑性脂肪。在單因素實驗的基礎上，采用Design Expert軟件進行響應面優化設計，反應條件包括：反應時間、反應溫度和酶添加量，以滑動熔點作為衡量指標。優化后得到最優反應條件為：反應時間4.2h，反應溫度64℃，酶添加量為7.2%，在最優反應條件下的酶法酯交換產物的實際滑動熔點可達37.9℃。對物理混合、酶法酯交換以及化學酯交換樣品進行了氧化穩定性研究，在儲藏30d內物理混合樣品的過氧化值為1.13～120.46meq/kg，低于酶法酯交換樣品（1.16～138.88meq/kg）及化學酯交換樣品（1.26～148.49meq/kg）。物理混合樣品的氧化穩定性高于酶法酯交換樣品，酶法酯交換樣品的氧化穩定性高于化學酯交換樣品。

塑性脂肪，酶法酯交換，響應面設計，油茶籽油，氧化穩定性

塑性脂肪是一種半固體的食品產品，其中含有液體的油和固體的脂。在對塑性脂肪基本理化性質的要求上，國內外研究的熱點在于豐富其營養組成以及降低膽固醇含量，制備出營養健康的人造奶油等塑性脂肪產品。塑性脂肪中的改性油脂選擇膽固醇含量較低的植物油脂，如大豆油，玉米油，菜籽油和橄欖油等。植物油脂的加入可降低產品的飽和度并增加產品塑性［2］。油茶籽油是從油茶籽中提取的油脂成分，其不飽和脂肪酸含量高達90%以上，其中油酸含量在80%左右，亞油酸含量在7%～13%，達到了FAO和WHO推薦的最佳食用油標準［6-7］，為使其塑性脂肪產品的脂肪酸組成更加合理，選擇棕櫚仁油作為另一種改性油脂，為人造奶油產品提供中鏈脂肪酸。

然而，將不同脂肪酸鏈長，不飽和鍵數量的甘三酯進行單純的物理混合會使最終產品的相容性出現差異，而導致產品的不良口感。酯交換技術則可在不同種類油脂的甘三酯碳骨架上進行脂肪酸的重排，使得混合物系呈現一種共晶狀態［4-5］，酯交換技術分為兩種，分別為化學酯交換和酶法酯交換。

對于人造奶油產品來說，除對其營養組成及理化性質的研究以外，對產品的氧化性研究也尤為重要。酯交換反應會使產品中自身的抗氧化成分遭到破壞，而使得產品的氧化穩定性下降，所以要全面的研究人造奶油產品性質，氧化穩定性也作為其重要的考察指標。

本文以棕櫚硬脂、油茶籽油和棕櫚仁油為原料，利用響應面設計對酶法酯交換工藝參數進行優化，以滑動熔點作為響應值［1］，制備出以油茶籽油為改性油的塑性脂肪，并對酶法酯交換產品的氧化穩定性與相同底物的化學酯交換產物及物理混合產物進行對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

52°分提棕櫚硬脂和棕櫚仁油 中糧集團；油茶籽油 江西好口福油脂公司；植物人造奶油 購自當地超市；Lipozyme TL IM 諾維信（中國）生物技術有限公司，酶活性為175IUN/g（IUN為酯交換活力單位），該酶的固定化材料為硅膠，酶的堆積密度為0.54g/m L，顆粒度為0.3～1.0mm，含水量為5%；冰醋酸 鄭州百佳化工有限公司；異辛烷 滁州市潤達溶劑公司；乙醚 慶茂化工有限公司；p-茴香胺 武漢福德精細化工有限公司；可溶性淀粉 鄭州陽光化工產品有限公司；碘化鉀 鄭州博軒化工產品有限公司；氯仿 濟南國光精細化工有限公司；檸檬酸 分析純，吳江奧康化學品有限公司。

1600PC紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；低頻脈沖核磁共振儀 Bruker公司；SHA-B恒溫水浴振蕩器 國華儀器公司；FA 1204B分析天平 上海天平儀器廠；HH-4丹瑞數顯恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實驗儀器廠；BGZ-246電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；BCD-215cm美的冰箱 合肥美的榮事達電冰箱有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品混合制備 將棕櫚硬脂在70℃下完全熔融，將棕櫚仁油在50℃下完全融化，與油茶籽油按照棕櫚硬脂：油茶籽油：棕櫚仁油為60∶30∶10（質量比）的比例進行混合（混合物的脂肪酸飽和度為50%左右），每份100g裝入250m L錐形瓶中，制得物理混合樣品及進行酯交換反應的混合油樣。

1.2.2 酶法酯交換反應 將混合油樣加熱至60℃后，根據實驗設計要求加入一定量的固定化酶，并將瓶中充滿氮氣后封口，在水浴搖床中進行酶法酯交換反應，水浴搖床的速度為200r/min。反應在指定溫度下進行，反應結束后，將反應瓶在60℃下靜置5m in待反應樣品與酶完全分離后，將上層油樣通過濾紙濾出，并放置在4℃下進行儲存備用［14-15］。

1.2.3 滑動熔點測定 根據AOCS Cc3-25［18］敞開式毛細管測定方法進行滑動熔點的測定。將油樣在60℃下完全融化，充分混勻后，靜置5m in至油樣中無氣泡，用兩只干凈的毛細管蘸入油樣中，樣品在毛細管中上升的高度為10mm時，立即放置在冰塊中冷凍樣品，使樣品凝固。并將毛細管放置在4～10℃下的冰箱中16h。取出毛細管后，用橡皮筋將毛細管綁在溫度計上，使得毛細管的底部與溫度計水銀球相平，并將綁好的溫度計放入裝有600m L冰水混合物的燒杯中，使溫度計的底部浸入到水中，調整起始水浴溫度使其低于樣品滑點溫度的8～10℃，打開電源，并攪拌，使加熱速率為1℃/m in，當接近滑點溫度時，速率降為0.5℃/min。記錄每根毛細管柱中油樣開始上升時的溫度，取平均值作為測定結果。

1.2.4 單因素及響應面實驗設計 以產物滑動熔點作為考察酶法酯交換程度的指標，對反應時間（A）為0、1、2、3、4、5、6、7、8h，反應溫度（B）為40、45、50、55、60、65、70、75、80℃及酶添加量（C）為4%、6%、8%、10%、12%（質量比）進行單因素實驗。在單因素實驗的基礎上，確定各因素的最佳水平范圍，利用Design Expert 8.0.6軟件進行Box-Benhnken響應面實驗設計，研究酶法酯交換工藝參數對產物滑動熔點的影響。以酶法酯交換反應時間（A），反應溫度（B）及酶添加量（C）為自變量，以滑動熔點（Y）為響應值，設計了三因素三水平的響應面分析實驗，因素水平編碼見表1。

表1 酶法酯交換實驗因素水平編碼表Table 1 Coding table of experiment factor for enzymatic interesterfication

1.2.5 化學酯交換 將制備好的混合油樣在60℃下完全融化倒入平底燒瓶中，在真空狀態下，利用加熱套將其加熱至105℃進行脫水，時間為30m in，然后迅速加入甲醇鈉，反應開始是以油樣變為紅褐色為標志，反應在105℃下反應30m in，加入10%的檸檬酸溶液終止反應。得到的反應產物需進行水洗至中性（pH=7）以去除多余的檸檬酸以及皂化物等。最后重復第一步對油樣進行脫水。脫水后制得的油品放置在4℃下進行儲藏［3］。

1.2.6 油脂氧化穩定性的測定 將物理混合樣品，酶法酯交換樣品及化學酯交換樣品放置在60℃烘箱中存放0～30d，每隔5d對其指標進行檢測，檢測指標為過氧化值和P-茴香胺值。

1.2.6.1 過氧化值的測定 根據AOCSCd 8b-9-2009標準進行乙酸-異辛烷方法測定［16］，由于樣品在常溫下易于凝固，故樣品測定前放置在水浴鍋中保溫。

其中：S—樣品滴定體積，m L；B—空白樣品滴定體積，m L；M—Na2S2O3標準溶液的摩爾濃度，mol/L；m—樣品質量，g。

1.2.6.2 P-茴香胺值的測定 根據AOCS Cd 18-90-2011標準進行測定［17］。準確稱量2g油樣置于25m L容量瓶中，用異辛烷溶解并稀釋到刻度成為未反應溶液，用異辛烷溶劑作空白。用移液管吸取未反應溶液5m L置于試管中，另一試管加入5m L異辛烷溶劑，分別加入1m L甲氧基苯胺試劑，振搖后靜置10min，在350nm處分別測定上述溶液吸光度。按下式計算p-茴香胺值：

其中：As—加入甲氧基苯胺試劑后油脂樣品的吸光度；Ab—未加入甲氧基苯胺試劑的油脂樣品的吸光度；m—油脂樣品的質量，g。

2 結果與討論

2.1 酶法酯交換反應條件優化

2.1.1 反應時間對酶法酯交換實驗的影響 Lipozyme TL IM酶添加量為8%（質量比）作為催化劑，反應在60℃下進行，測定不同反應時間下反應產物的滑動熔點變化結果見圖1。

圖1 反應時間對酶法酯交換反應的影響Fig.1 Effect of reaction time on enzymatic interesterification

反應時間0h時為棕櫚硬脂/油茶籽油/棕櫚仁油（60∶30∶10，質量比）物理混合后的滑動熔點（48.5℃）。通過結果可得出2～4h滑動熔點變化顯著（p＜0.05），4～6h滑動熔點變化不顯著，6h后滑動熔點略有上升，所以確定4h反應基本達到平衡狀態，滑動熔點作為指標值較為宏觀的反映了酯交換的反應程度，其主要可以代表酯交換產物的甘三酯中脂肪酸位置上的變化，反應時間不宜過長，因為隨著時間的延長，發生?；灰频膸茁蕰黾樱赃x擇反應時間為4h。

2.1.2 反應溫度對酶法酯交換實驗的影響 確定反應時間為4h，酶添加量為8%（質量比），測定不同溫度下產物的滑動熔點結果見圖2。

圖2 反應溫度對酶法酯交換反應的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on enzymatic interesterification

通過圖2可得出，40～60℃滑動熔點呈線性下降趨勢，變化顯著（p＜0.05）；70℃下的滑動熔點雖低于60℃，但因為酶法酯交換反應為熱動力學過程，反應溫度對酯交換反應影響較大，反應溫度過低使得酶活無法達到最大，反應溫度升高會加快反應速率和酯交換程度，但反應溫度過高卻會使酶失活，導致反應速率下降。綜合考慮后最終選擇的反應溫度為60℃。2.1.3 酶添加量對酶法酯交換實驗的影響 確定反應時間為4h，反應溫度為60℃，測定不同酶添加量下，反應后產物的滑動熔點結果見圖3。

圖3 酶添加量對酶法酯交換反應的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on enzymatic interesterification

通過實驗可以看出，當酶添加量小于8%時，產物的滑動熔點隨酶添加量的增加而降低，這表明酯交換程度隨酶添加量的增加而增加；當酶添加量為12%時，滑動熔點略有上升，這是由于當酶添加量增加到一定量時，底物和產物傳質阻力的影響已開始大于酶反應催化速率的影響，使得酶的催化效率降低。

滑動熔點的變化主要是由混合物甘三酯組成中的高熔點甘三酯，中熔點甘三酯及低熔點甘三酯的含量變化導致的，酯交換為碳骨架上的脂肪酸位置的重排，使得高熔點甘三酯含量下降，中熔點甘三酯含量增加，使得滑動熔點降低，所以滑動熔點能宏觀的反映酯交換程度。通過結果可知，當酶添加量達到8%時，隨著酶添加量的增加，產物滑動熔點降低幅度減少，故選擇酶添加量為8%。

2.2 酶法酯交換反應條件響應面優化

以單因素實驗為基礎，利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Benhnken進行三因素三水平的實驗設計，以棕櫚硬脂/油茶籽油/棕櫚仁油（60∶30∶10，質量比）作為底物，其中影響因子為反應時間（3、4、5h），反應溫度（55、60、65℃）及酶添加量（6%、8%、10%），響應值為產物的滑動熔點。實驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Response surface design and rerults

通過統計分析軟件Design Expert8.0.6進行多元回歸擬合，以滑動熔點（Y）與反應時間（A），反應溫度（B）以及酶添加量（C）之間建立響應面回歸模型如下：

對其數據分析結果進行方差分析，結果如表3。

通過方差分析結果可以看出，模型中整體擬合度顯著（p＜0.05），且R2=96.65%，R2adj=92.34%，說明該模型的建立與實驗的擬合度良好，可預測性高達96.65%，具有高度的可信性，A、B、A2極顯著（p＜0.01），AB顯著（p＜0.05），其余項均無顯著影響。通過方差分析的F值可知三個因素對響應值滑動熔點的影響程度的排序為：B＞A＞C，即反應溫度＞反應時間＞酶添加量。

統計分析后，以滑動熔點作為響應值，根據市售塑性脂肪產品的滑動熔點作為衡量標準，滑動熔點在38℃左右的產品具有良好的塑性性質，所以優化時以滑動熔點38℃為最優條件，得到酯交換反應最優的工藝參數為反應時間為4.2h，反應溫度為64℃，酶添加量為7.2%，在此條件下的理論響應值為38.0℃。通過驗證實驗，得到的實際滑動熔點為37.9℃，表明實際反映使得高熔點甘三酯明顯下降，中熔點和低熔點甘三酯含量升高，但其誤差小于1%，即說明該模型對酯交換反應的條件優化具有實際意義。通過與物理混合滑動熔點對比得出（見表4），酶法酯交換后的滑動熔點明顯降低，而化學法酯交換產物的滑動熔點低于酶法酯交換產物，這是由于化學酯交換為隨機酯交換，其甘三酯組成與酶法酯交換的存在差異。

表3 方差分析結果Table 3 ANOVA for response surface model

表4 驗證實驗理論值及實際值結果Table 4 Results of the verification test

2.3 酯交換產品氧化穩定性

過氧化值是評價油脂氧化程度的重要指標，從整體上看，物理混合樣品的過氧化值在儲藏過程中低于酶法酯交換產物及化學法酯交換產物，而酶法酯交換產物的過氧化值低于化學法酯交換產物（見表5），Fauzi等［10-13］在之前的研究中也得到了相似的結論。這是由于物理混合樣品中含有天然抗氧化劑，并且未被破壞，而化學法酯交換在三種改性方式中反應條件最為劇烈，抗氧化劑在此過程中遭到破壞，使得其抗氧化效果明顯降低。相較于化學酯交換，酶法酯交換反應條件溫和，氧化穩定性優于化學法酯交換。

表5 三種樣品的過氧化值Table 5 Peroxide value of the three samples

P-茴香值是氫過氧化物產生的二級氧化產物的標志，用于衡量油脂氧化的次級階段。通過表6得出，隨著時間的增加，P-茴香胺值隨之增加，當儲藏時間為20d時，P-茴香胺值有明顯上升，這是由于不穩定的初級氧化產物（氫過氧化物）分解形成了醇、醛、酮、酸以及環狀化合物等次級氧化產物，物理混合樣品P-茴香胺值最低，酶法酯交換產物P-茴香胺值略低于化學酯交換產物，其整體變化趨勢與過氧化值相似，同樣在相關文獻中得出了相似的結論［8］。

表6 三種樣品的P-茴香胺值Table 6 P-Anisidine of the three samples

3 結論

以棕櫚硬脂，油茶籽油和棕櫚仁油為原料進行酶法酯交換制備塑性脂肪的反應條件優化，反應條件包括反應時間，反應溫度及酶添加量，響應值為產物滑動熔點，以單因素實驗為基礎，確定中心點后，進行響應面設計，得出最佳的反應條件參數為反應時間4.2h，反應溫度為64℃，酶添加量為7.2%，并且在最佳反應條件下的滑動熔點可達37.9℃。通過30d的儲藏時間對物理混合樣品、酶法酯交換產物及化學酯交換產物性質進行對比后發現，物理混合氧化穩定性高于酶法酯交換樣品，而化學酯交換產物的氧化穩定性低于酶法酯交換樣品，說明以油茶籽油、棕櫚仁油作為改性油脂，利用酶法酯交換可制備塑性脂肪。

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Optimization enzymatic interesterification process to produce p lastic fat and study of oxidative stability

ZHANG Chao-ran1，LIYang1，SUN Xiao-yang2，WANG Sheng-nan1，QIBao-kun1，LIDan1，M AW en-jun1，JIANG Lian-zhou1，*，SUIXiao-nan1
（1.Department of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Novozymes（Shandong）Innovation&Business Center，Ji'nan 250101，China）

Plastic fatwas produced by enzymatic interesterification with palm stearin and camellia seed oil.Based on single factor experiments，the interesterification conditions was optimized by a response surface design through the Design Expert software，which included reaction time，reaction temperature and enzyme addition. The response value was the slipping melting point.The result of the op timization was 4.2h（reaction time），64℃（reaction temperature），7.2%（enzyme add ition）.Under this condition，the real response value was 37.9℃. Oxidative stability was com pared to the samples physical blends，the enzymatic and chemical interesterified blends.The peroxidate values of the physicalb lend during the storage time for 30 days were 1.13～120.46meq/kg which were lower than those of the enzymatic interesterified blends（1.16～138.88meq/kg）and the chem ical interesterified blends（1.26～148.49meq/kg）.The study demonstrates the oxidative stability of physical b lend was higher than that of the enzymatic interesterified blends and the enzymatic interesterified blends was more stability than the chemical interesterified blends.

plastic fat；enzymatic interesterification；response surface design；camellia seed oil；oxidative stability

TS225.6

A

1002-0306（2015）08-0114-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.014

2014－07－24

張超然（1989-），女，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

*通訊作者：江連洲（1960-），男，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

國家“863”計劃（2013AA102104-1）；大豆產業技術體系崗位專家（CARS-04-PS25）。