分散固相萃取-氣相色譜法同時測定水產(chǎn)品中六種丁香酚類麻醉劑的殘留量

陳 煥，黃 和，*，高 平，楊嘉麗，黃國方，劉文俠

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東湛江524088；2.國家海產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（湛江），廣東湛江524094）

分散固相萃取-氣相色譜法同時測定水產(chǎn)品中六種丁香酚類麻醉劑的殘留量

陳 煥1，黃 和1，*，高 平2，楊嘉麗2，黃國方2，劉文俠2

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東湛江524088；2.國家海產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（湛江），廣東湛江524094）

建立了同時檢測水產(chǎn)品中六種丁香酚類麻醉劑殘留量的分散固相萃取-氣相色譜檢測方法。樣品經(jīng)丙酮進行提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后定容，采用分散固相萃取（DSPE）凈化，用氣相色譜儀進行測定，外標法定量。六種丁香酚類化合物在0.05～10.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)R2為0.9995～0.9999。又分別在羅非魚、南美白對蝦、鰻鱺以及梭子蟹肌肉樣品中添加0.1～1.0mg/kg的混合標準溶液，測定平均回收率在80.3%～103.2%范圍內(nèi)，相對標準偏差在0.7%～5.4%之間。方法的定量限（LOQ），六種丁香酚類化合物（丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基異丁香酚）均為0.1mg/kg。

氣相色譜，分散固相萃取，水產(chǎn)品，丁香酚類，殘留量

丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基異丁香酚均屬于丁香酚類化合物，因其在漁用麻醉方面較其他麻醉劑具有成本低、效果好、殘留期短等特點［1-2］，而近年來受較多關注。澳大利亞、新西蘭、智利等國家已把丁香酚類化合物列為沒有殘留期的合法水產(chǎn)品麻醉劑。而美國國家毒理學計劃（NTP）發(fā)布的毒理學數(shù)據(jù)顯示，丁香酚類化合物對嚙齒動物是致癌物或潛在的致癌物，其安全性值得懷疑。日本肯定列表中丁香酚類化合物在水產(chǎn)品中的最高殘留量也都有限制，而我國對丁香酚類化合物殘留方面的限制目前還處于空白階段。因此，亟需建立水產(chǎn)品中多種丁香酚類化合物的簡便、高效、準確的樣品前處理方法和儀器定量、驗證方法。

目前，國內(nèi)外報道丁香酚類化合物的檢測多為生物樣品、食品以及一些藥品，主要有HPLC法［3-4］、GC法［5-6］、GC-MS［7-8］、TLC法［9］和毛細管電泳法［10］等，這些方法前處理較簡單，大多直接用有機提取溶劑進行提取后上機檢測，檢出限和定量限都較高，無法滿足復雜的水產(chǎn)品基質(zhì)中殘留限量的要求。分散固相萃取（QuEChERS）是2003年提出的一種快速、簡單、低成本的樣品前處理方法［11］，與傳統(tǒng)的固相萃取的方法相比，省去了淋洗、洗脫、轉(zhuǎn)溶、乳化濃縮而造成的目標物的損失。國內(nèi)外報道的已有很多種藥物殘留可用該方法進行分析，但將此方法應用于水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑的殘留分析尚未報道。本研究以常見的幾種水產(chǎn)品為基質(zhì)，運用氣相色譜法檢測其中六種丁香酚類化合物殘留，旨在建立一種能同時檢測水產(chǎn)品中六種丁香酚類麻醉劑的簡便、準確、靈敏的方法，為以后相關標準的制定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

羅非魚、南美白對蝦、鰻鱺和梭子蟹 均由湛江市國聯(lián)水產(chǎn)有限公司提供，實驗前，將活羅非魚、鰻鱺洗凈去皮、去鱗取可食用肌肉部分，用刀片將其切成大小為0.5cm×0.5cm×0.5cm小塊，南美白對蝦、梭子蟹去殼、去頭，取凈肌肉部分，然后用組織勻漿機把樣品絞碎混勻，分別標記并裝入樣品袋中，放入-18℃下冰箱中保存?zhèn)溆茫瑢嶒灂r將其從冰箱中拿出自然解凍至室溫；丁香酚（CAS號：97-53-0）、甲基丁香酚（CAS號：93-15-2）、異丁香酚（CAS號：97-54-1）、甲基異丁香酚（CAS號：93-16-3）、乙酸丁香酚酯（CAS號：93-28-7）、乙酰基異丁香酚（CAS號：93-29-8）標準品 上海安譜科學儀器有限公司，純度均為97%；丙酮、正己烷、無水乙醇、無水乙醚、氯化鈉 廣東光華科技股份有限公司，均為分析純；無水硫酸鈉、無水硫酸鎂（實驗前600℃下灼燒4h，放于干燥器中冷卻） 天津大茂化學試劑廠，均為分析純；N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）吸附劑、石墨化碳黑（GCB） 德國CNW科技公司。

GC-2010 Plus氣相色譜儀 日本島津公司；VTX 3000L漩渦混勻器 日本EYELA；Heraeus馬弗爐 美國Thermo公司；HR2860組織勻漿機 珠海飛利浦；R-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（配國產(chǎn)冷凝水循環(huán)系統(tǒng)，水溫設置為5℃） 瑞士BUCHI；SIGMA 3-18K高速冷凍離心機 德國；TDL-5-A臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；LE-500A分析天平 佛山廣華天力天平廠；XS-205電子分析天平 瑞士METTLER-TOLEDO公司；HU3120B超聲波清洗器 天津恒奧。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 提取 準確稱取5g（精確到0.01g）已處理好的樣品，放于準備好的50m L塑料離心管中，然后加入5g經(jīng)灼燒的無水硫酸鈉、3g氯化鈉、15m L丙酮，蓋緊塑料旋塞，搖勻振蕩2min后，12000r/min均質(zhì)60s，以4000r/m in冷凍離心機離心10m in，吸出上清液于100m L雞心瓶中；殘渣再加入15m L丙酮重復上述步驟提取，4000r/m in離心，合并上清液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約0.5m L左右。

1.2.1.2 凈化 加入混合溶液（乙酸乙酯∶正己烷= 1∶1，v/v）溶解殘余物并轉(zhuǎn)移到10m L玻璃離心管中，準確定容至4m L于漩渦振蕩器上振蕩1m in，靜置。準確量取2m L上述溶液于事先準備好的裝有300mg無水硫酸鎂、75mgPSA、75mg C18以及15mgGCB的10m L玻璃試管中，漩渦振蕩1～2min后4000r/min離心5min，取上層溶液過0.45μm有機濾膜，供氣相色譜儀分析。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：ZB-1701毛細管色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；進樣口溫度：230℃；程序升溫：柱溫初始為80℃保持1min，然后以10℃/min升至200℃，保持4m in，再以20℃/m in升至230℃，保持10m in；檢測器及溫度：FID檢測器，300℃；載氣：高純氮氣；進樣模式：不分流進樣；進樣量：1μL。

1.2.3 標準溶液的配制 分別準確稱取0.100g（精確至0.0001g）丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基異丁香酚六種標準品，用混合溶劑（乙酸乙酯∶正己烷=1∶1，v/v）分別溶解于棕色容量瓶中并定容到100m L，配制成1000μg/m L標準儲備液，放于-18℃冰箱保存，有效期6個月。使用時用混合溶劑（乙酸乙酯∶正己烷=1∶1，v/v）將儲備液稀釋成所需要的濃度作為標準溶液。

泰州大橋除了針對橋梁設施安全等重點關注部位和養(yǎng)護作業(yè)、排障作業(yè)等重點關注作業(yè)外，還應用長大橋隧設施及運營安全監(jiān)測預警與應急管理系統(tǒng)、長大橋隧視頻拼接檢測系統(tǒng)、長大橋隧災情推演及應急管理系統(tǒng)等先進技術，在服務區(qū)、收費站等非重點關注部位設置風險告知牌，實現(xiàn)了風險的可視化呈現(xiàn).

1.2.4 樣品加標回收率實驗 稱取不含六種丁香酚類化合物的空白樣品后，加入適量的六種混合丁香酚標準工作液，于室溫下靜置30m in后按1.2.1樣品前處理方法處理樣品及1.2.2色譜條件進樣分析，以保留時間定性，外標法定量。

2 結果與討論

2.1 提取溶液的選擇

丁香酚類化合物（丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基異丁香酚）屬于極性或者弱極性化合物，幾乎不溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有機溶劑。根據(jù)參考文獻報道［12-17］，有采用正己烷、無水乙醇、甲醇、丙酮、無水乙醚等作為丁香酚含量測定的提取溶劑。因此，本實驗研究了常用的正己烷、無水乙醇、丙酮和無水乙醚四種有機溶劑作為提取溶劑對六種丁香酚類化合物的提取效果影響。并在空白對蝦肌肉中添加濃度為2.0μg/m L的混合標準溶液，按照1.2.1的前處理方法處理樣品后，上機測定，同時計算平均回收率和精密度，結果見表1。

從表1可以看出，無水乙醚提取時，溶液顏色較深，雜質(zhì)干擾較多且基線噪音較大，影響了檢測的靈敏度；雖然經(jīng)正己烷提取后溶液顏色較淺，雜質(zhì)干擾少且基線較平穩(wěn)，但乙酸丁香酚酯和乙酰基異丁香酚的平均回收率較低，影響了檢測效果；丙酮、無水乙醇提取后平均回收率都較高且相差不大，但丙酮作為提取劑時，溶液顏色稍淺，雜質(zhì)干擾和基線噪音都優(yōu)于無水乙醇，而且在提取溶液濃縮的過程中，丙酮的濃縮速度也較無水乙醇快，節(jié)省了前處理的時間。因此，本實驗采用丙酮作為六種丁香酚類化合物的提取溶劑。對蝦樣品中四種不同提取溶劑的提取效果色譜圖如圖1所示。

圖1 無水乙醚（a）、正己烷（b）、丙酮（c）、無水乙醇（d）四種提取溶劑提取色譜圖Fig.1 The chromatogram of four kinds of extraction solvent by Anhydrous ether（a），hexane（b），acetone（c），ethanol（d）

2.2 提取方式的選擇

實驗研究了漩渦振蕩、均質(zhì)、超聲提取三種提取方法對對蝦肌肉中六種丁香酚類化合物的提取效果的影響，結果見表2。三種提取方法所得到的平均回收率都較高，且峰形均較好，雜質(zhì)干擾都較少。但均質(zhì)提取所消耗的時間最少，并且采用均質(zhì)方式提取時，能夠?qū)悠肪|(zhì)完全，提取溶液完全滲入樣品基質(zhì)中，更加有利于提取溶劑在短時間內(nèi)對基質(zhì)樣品中目標化合物的提取。因此，選擇均質(zhì)方法提取六種丁香酚類化合物。

表2 不同提取方法對六種丁香酚類化合物的提取效果的影響（n=5）Table 2 Effects of differentextractionmethods on the extraction effect of six kinds of eugenol compounds（n=5）

2.3 凈化條件的選擇

水產(chǎn)品種類繁多，并且成分復雜，采用單純的提取液提取、濃縮后無法除去基質(zhì)中大部分雜質(zhì)的干擾。羅非魚、鰻鱺均含有較高的脂肪，同時南美白對蝦、梭子蟹肌肉中蛋白質(zhì)的含量較高，并且含有脂溶性色素、有機酸以及脂肪酸等雜質(zhì)，必須結合凈化方法更好的去除樣品中的雜質(zhì)才能上機檢測。樣品凈化前，采用冷凍離心的方式能夠使部分蛋白質(zhì)變性、脂肪冷凝沉淀而除去，但無法完全去除其他的雜質(zhì)干擾。乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）含有伯胺和仲胺基團，對水產(chǎn)品中有機酸、糖類以及極性脂肪酸等均有良好的保留作用；C18能夠較好的除去提取液中脂肪以及非極性碳水化合物［18-19］。因此，本實驗研究了PSA和C18作為分散固相吸附劑吸附雜質(zhì)，以對提取冷凍離心后溶液進行凈化，將不同用量的PSA（25、50、75、100、150mg）和C18（50、75、100mg）分別加入到2m L混合標準溶液（5.0μg/m L）中，六種丁香酚類化合物的回收率見表3。

結果表明，三種雜質(zhì)吸附劑對六種丁香酚類化合物的吸附均較小。隨著PSA、C18含量的增加，丁香酚類化合物含量減少，說明其對雜質(zhì)的吸附作用增加，致使丁香酚類化合物回收率偏低，降低了測量的準確性；但PSA、C18用量越大對樣品中雜質(zhì)的吸附作用也越好，因此選擇PSA、C18含量均為75mg進行下一步實驗。

石墨炭黑（GCB）能夠有效的去除對蝦及梭子蟹中脂溶性色素，使上機前溶液顏色變得澄清，排除雜質(zhì)的干擾，因此研究了GCB用量為15、25mg時對提取效果的影響，結果見表3。當GCB用量為15mg和25mg時，凈化后的溶液較澄清，幾乎無色；而GCB用量為15mg時，對目標化合物的吸收相對較小，各目標化合物的回收率相對較高，因此選擇GCB含量為15mg進行下一步的實驗。

2.4 方法的線性范圍和定量限

將標準儲備液用混合溶劑（乙酸乙酯∶正己烷= 1∶1，v/v）分別逐級稀釋，配制成0.05、0.10、0.25、0.50、1.0、5.0、10.0μg/m L的標準工作液，按照1.2.2中的色譜條件進行分析，以標準工作液濃度（x，μg/m L）為橫坐標，以峰面積（y）為縱坐標作圖，建立線性回歸方程，結果表明：六種丁香酚類化合物在0.05～10.0μg/m L范圍內(nèi)，線性關系良好，相關系數(shù)在0.9995～0.9999之間。以10倍信噪比（S/N）計算定量限，該方法的定量限（LOQ）六種丁香酚類化合物均為0.1mg/kg。六種丁香酚類化合物的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)如表4所示。

圖2 六種混合標準溶液色譜圖（5.0μg/mL）Fig.2 The chromatogram of six kinds ofmixed mark solution（5.0μg/mL）

圖3 空白對蝦樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of Shrimp blank sample

圖4 對蝦樣品加標色譜圖（1.0mg/kg）Fig.4 Chromatogram of Shrimp spiked sample（1.0mg/kg）

表3 不同用量的PSA、C18和GCB對六種丁香酚類化合物的回收率影響Table 3 The recovery rate effects of six kinds of eugenol derivatives by different dosage of PSA、C18and GCB

表4 六種丁香酚類化合物的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)和定量限Table 4 The linear range，linear equations，correlation coefficient，quantification limitof six kinds of clove phenol compounds

六種丁香酚類化合物混合標準溶液色譜圖、空白對蝦和羅非魚樣品色譜圖以及對蝦和羅非魚樣品加標色譜圖如圖2～圖6所示。

圖5 空白羅非魚樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of Tilapia blank sample

圖6 羅非魚樣品加標色譜圖（1.0mg/kg）Fig.6 Chromatogram of Tilapia spiked sample（1.0mg/kg）

2.5 方法的加標回收率和精密度

向空白羅非魚、南美白對蝦、鰻鱺以及梭子蟹肌肉樣品中分別添加濃度為0.1、0.2、1.0mg/kg水平的混合標準溶液，每個濃度設5個平行，同時設一個空白對照，計算六種丁香酚類化合物的加標回收率及相對標準偏差（RSD），結果見表5。結果顯示，六種丁香酚類化合物添加水平為0.1～1.0mg/kg時，其加標平均回收率為80.3%～103.2%，相對標準偏差為0.7%～5.4%，表明該方法的準確性和重現(xiàn)性好，符合殘留分析要求。

表5 六種丁香酚類化合物加標回收率和相對標準偏差（n=5）Table 5 The standard addition recoveries and relative standard deviation of six kinds of clove phenol compounds（n=5）

3 結論

建立了一種同時檢測水產(chǎn)品中六種丁香酚類麻醉劑（丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基異丁香酚）的分散固相萃取-氣相色譜檢測方法。樣品經(jīng)丙酮提取后濃縮，分散固相萃取劑進行凈化，方法操作簡單，處理后樣品雜質(zhì)干擾較少且基線平穩(wěn)，方法的靈敏度和回收率都較高，重現(xiàn)性好，適合于批量水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑的殘留檢測。此研究結果為水產(chǎn)品中丁香酚類化合物殘留檢測提供了有效的前處理方法和檢測手段，因此，本研究對以后丁香酚類麻醉劑檢測標準的制定具有有效的參考價值。

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Determination of six clove phenoldrug residues in aquatic products by gas chromatography with dispersive solid-phase extraction

CHEN Huan1，HUANG He1，*，GAO Ping2，YANG Jia-li2，HUANG Guo-fang2，LIUW en-xia2
（1.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，Zhanjiang 524088，China；2.National Marine Products Quality Supervision&Inspection Center（Zhanjiang），Zhanjiang 524094，China）

A dispersive solid-phase extraction-gas chromatography（GC）method had been developed for the detection of six kinds of eugenold rug residues in aquatic products at the same time.Sample was ultrasonic extracted by acetone，constant volume after rotary evaporation concentration，using dispersive solid-phase extraction（DSPE）purification，determined by gas chromatograph.External standard calibration was adopted in the determination.Six kinds of eugenol type of anesthetic showed good linearity in the concentrations range of 0.05～10.0μg/m L for the standard solutions carves，and all of the correlation coefficents（R2）were in 0.9995～0.9999.At the sp iked levels of 0.1～1.0mg/kg in tilap ia，south America white shrimp，eel，swimming crab muscle，the average recoveries were 80.3%～103.2%.The relative standard deviations were 0.7%～5.4%.The limits of quantificationg（LOQ），all of the six kinds of eugenol drug residues（Eugenol，Methyl eugenol，Iso-eugenol，Methyl iso-eugenol，Eugenolacetate，Acetyl iso-eugenol）were 0.1mg/kg.

gas chromatog raphy；dispersive solid-phase extraction（DSPE）；aquatic products；c love phenol；residual quantity

TS254.7

A

1002-0306（2015）08-0088-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.009

2014－07－15

陳煥（1988-），男，在讀碩士研究生，主要從事食品質(zhì)量與安全方面的研究。

*通訊作者：黃和（1962-），男，本科，教授，主要從事食品質(zhì)量與安全方面的研究。

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2013QK272）。