mir－181c抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的作用機(jī)制研究

李 勇 王莉華

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 鄭州 450007

50%的神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）發(fā)生在2 歲以?xún)?nèi)的嬰幼兒。NB預(yù)后差別很大，有廣泛的腫瘤異質(zhì)性［1］。低危組NB患者（嬰幼兒）臨床觀察或手術(shù)可以取得良好療效；高危組NB患者即使綜合治療預(yù)后仍不佳。NB 屬于神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤，超過(guò)50%的神經(jīng)母細(xì)胞瘤病人發(fā)生轉(zhuǎn)移，尤其骨轉(zhuǎn)移嚴(yán)重威脅兒童的健康［2］。盡管有許多因素與NB發(fā)病機(jī)制相關(guān)［3］，但對(duì)關(guān)鍵分子機(jī)制和NB終末期決定因素尚未清楚。因此，識(shí)別新介質(zhì)對(duì)NB 發(fā)病機(jī)制非常重要。本課題擬對(duì)mir－181c在NB中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討。

1 實(shí)驗(yàn)步驟

1.1 組織樣本和細(xì)胞系 12個(gè)NB組織從鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)外科獲得。經(jīng)組織病理學(xué)檢查確認(rèn)，并存儲(chǔ)在－80液態(tài)氮。人類(lèi)NB細(xì)胞系SK－N－SH 和SH－SY5Y 培養(yǎng)在（Eagle＇s Minimum Essential Medium EMEM Gibco），用10%胎牛血清緩沖，補(bǔ)充100 U／mL 青霉素／鏈霉素（PEST）。所有細(xì)胞都保存在5%CO237 ℃濕潤(rùn)孵化器。

1.2 寡核苷酸合成和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 MiR－181c模塊，miR－181c反義寡核苷酸（AOS），模塊（mimics－ctrl），ASO 控件（ASOctrl），購(gòu)買(mǎi)于上海基因制造公司。使用Lipofectamine TM 2 000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（英杰公司）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.3 RNA 的提取和實(shí)時(shí)定量PCR 根據(jù)制造商的說(shuō)明方案，使用Trizol提取總的RNA。使用NanDrop ND－1000分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定RNA 的濃度和質(zhì)量。然后使用1μg 的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。對(duì)于miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用特定的miR－181cRT 引物，然后用于總RNA 的逆轉(zhuǎn)錄，Oligo（dT）作為一個(gè)通用的引物，使用SYBR GreenPCR 混合物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。條件如下：95℃5min，隨后40個(gè)循環(huán)的95℃30s，57 ℃30s，72 ℃30s。RNU6B（U6 小 核 乙 非 編 碼RNA）作為miR－181c正常表達(dá)的所有使用的引物如下：miR－181c RT primer：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCACCG 3’；U6 RT primer：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AAAATATGGAAC3’；miR－181cforward primer：5’ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACCTG 3’；U6 forward primer：5’ACACTCCAGCTGGGGTGCTCGCTTCGGCAGCACA 3’；Reverse primer：5’TGGTGTCGTGGAGTCG 3’。

1.4 腫瘤細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)（MTT） 鋪96孔板，4 000個(gè)／每孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h 后，用MTT 培養(yǎng)4h。加入DMSO 100μL，解除MTT 并將細(xì)胞放置搖晃10min。用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值A(chǔ)（波長(zhǎng)570nm）。細(xì)胞增殖率（%）＝ATest／AControl×100%。

1.5 集落形成試驗(yàn)（克隆實(shí)驗(yàn)） 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種到12孔板中，密度為200個(gè)細(xì)胞／孔。將培養(yǎng)液每3d更換1次，孵育10～14d。當(dāng)大多數(shù)克隆含超過(guò)50個(gè)細(xì)胞時(shí)，終止孵育。用1×PBS洗脫克隆，冷甲醇固定克隆細(xì)胞，結(jié)晶紫染色約5min。將克隆進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。集落形成率＝克隆數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 Transwell小室遷移試驗(yàn)和侵襲試驗(yàn) 無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，消化細(xì)胞并離心收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度2.5×104）250μL加入Transwell上室，腔室底部則加入750 μL的含10%～20%血清的培養(yǎng)液。20h后取出Transwell小室，使用棉簽輕輕擦拭小室上層細(xì)胞，使用4%多聚甲醛固定Transwell小室。取出固定好的小室，使用自來(lái)水沖洗小室，結(jié)晶紫染色15 min沖洗。將染好色的小室經(jīng)梯度酒精脫水，風(fēng)干后取下膜層，用中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下計(jì)數(shù)即可。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所有數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，2組間比較采用雙樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mir－181c抑制NB組織轉(zhuǎn)移 如圖1示，mir－181c的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)移NB組織中表達(dá)降低，與原發(fā)NB組織中表達(dá)水平形成顯明對(duì)比，表明mir－181c與腫瘤生成有關(guān)。

圖1 定量RT－PCR分析Mir－181c表達(dá)率，＊P＜0.05

圖2 mir－181c抑制SK－N－SH 細(xì)胞

2.2 mir－181c抑制SK－N－SH 細(xì)胞擴(kuò)散 經(jīng)RT－PCR 驗(yàn)證了2個(gè)細(xì)胞系，mir－181c模塊或mir－181cASO 轉(zhuǎn)染的SK－NSH 細(xì)胞。MTT 分析 顯 示，mir－181c可 降 低SK－N－SH 細(xì) 胞的活力約20%，而抑制了mir－181c細(xì)胞生存能力提高約25%。mir－181c對(duì)SH－SY5Y 細(xì)胞也有相似的作用。從克隆形成實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)mir－181c的超表達(dá)減少SK－N－SH 克隆細(xì)胞約50%，而抑制mir－181c表達(dá)可導(dǎo)致相反的影響。表明mir－181c可能在腫瘤的生長(zhǎng)起重要作用。見(jiàn)圖2。

2.3 mir－181c抑制SK－N－SH 和SH－SY5Y 細(xì)胞的遷移和入侵 為確定mir－181c是否與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，我們采用Transwell檢測(cè)了mir－181c影響細(xì)胞遷移和入侵作用。發(fā)現(xiàn)mir－181c超表達(dá)減少了遷移和入侵SK－N－SH 細(xì)胞數(shù)量分別為約40%和50%，而抑制mir－181c起相反效果。圖3 顯示mir－181c超表達(dá)減少了遷移和入侵SH－SY5Y 細(xì)胞的數(shù)量。表明mir－181c參與了NB的遷移。

圖3 mir－181c抑 制SK－N－SH 和SH－SY5Y 細(xì) 胞 的 遷移和入侵

3 討論

研究表明miRNA 參與多種生物過(guò)程，包括細(xì)胞的分化、增殖和凋亡［4－5］。超過(guò)50%的miRNA 擁有與癌基因相結(jié)合的脆裂點(diǎn)［6］，到目前為止發(fā)現(xiàn)60%的蛋白編碼基因受miRNA 的調(diào)控［7－8］。研 究 表 明，miRNA 扮 演2 個(gè) 角 色（致 癌 基因／抑癌基因），如mir－490－3p作為一個(gè)致癌因子促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和入侵，而且還會(huì)靶向作用于ERGIC3導(dǎo)致肝細(xì)胞肝癌的上皮間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）［9］。mir－125b抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移特征通過(guò)靶向下調(diào)致癌基因ETS1完成［10］。

許多關(guān)于miRNA 對(duì)NB 組織下調(diào)機(jī)制的研究報(bào)道，但關(guān) 于miRNA 對(duì)NB 組 織 上 調(diào) 機(jī) 制 研 究 仍 很 少［11－12］。mir－335通 過(guò)調(diào)節(jié)TGF－β信 號(hào) 通 路 抑 制NB 細(xì) 胞 入 侵［13］，mir－9通過(guò)靶向作用于MMP－14抑制NB 細(xì)胞的入侵和遷移［14］。mir－15a通過(guò)mir－15a／RECK／MMP－9 軸 促 進(jìn)NB 細(xì) 胞 的 遷移和生長(zhǎng)［15］。研究人員在miRNA 對(duì)NB 組織的分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)及免疫機(jī)制有抑制作用［7］。

NB是兒童常見(jiàn)的實(shí)質(zhì)性惡性腫瘤，可表現(xiàn)為預(yù)后多樣性，NB病因尚不清楚。研究人員進(jìn)行了堿基配對(duì)改變和重排后與NB有關(guān)聯(lián)基因中發(fā)現(xiàn)了癌癥特異性基因突變，其中ARID1A 和ARID1B基因突變與患兒病死率有關(guān)，而且還發(fā)現(xiàn)N－myc基因的擴(kuò)增突變?cè)贜B 中常見(jiàn)，呈雙向擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)此擴(kuò)增方式與腫瘤的擴(kuò)散相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，一些蛋白酶與NB發(fā)病有關(guān)，在腫瘤生物進(jìn)程中起重要作用。在鼠體內(nèi)模型中檢測(cè)54個(gè)與NB有關(guān)的miRNA，發(fā)現(xiàn)35個(gè)上調(diào)，下調(diào)19個(gè)，部分miRNA 在原發(fā)NB 和轉(zhuǎn)移NB 中的表達(dá)有明顯差異，說(shuō)明這些表達(dá)有差異的基因在NB轉(zhuǎn)移中起重要的作用，還發(fā)現(xiàn)NB中基質(zhì)金屬蛋白酶14（MMP－14）與腫瘤病理特性及預(yù)后生存率密切相關(guān)。

MiR－181家族里6個(gè)基因，這些miRNAs均由3個(gè)獨(dú)立的染色體編碼，并產(chǎn)生4個(gè)成熟的miRNA。研究表明，miR－181s在肝細(xì)胞肝癌中超表達(dá)并參與細(xì)胞分化［16］。在肝細(xì)胞肝癌中，TGF－β（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β）可通過(guò)抑制TIMP3 上調(diào)miR－181b，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和入侵［17］。Mir－181c通過(guò)下調(diào)BMPR2 而與室中隔缺損有關(guān)［18］。胃癌中高表達(dá)mir－181c與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，表明mir－181c可能是致癌基因［19］。Fanconi貧血中mir－181c具有促進(jìn)TNF－α克隆潛能作用［20］，表明miR－181家族在包括癌癥的很多疾病的發(fā)生中起促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)用mir－181c－mmics和AOS－mir－181c轉(zhuǎn)染NB 細(xì)胞，MTT 分析顯示mir－181c降低細(xì)胞活力約20%，colony實(shí)驗(yàn)示減少NB細(xì)胞克隆約50%，2組間抑制細(xì)胞生長(zhǎng)率有明顯差異，說(shuō)明mir－181c對(duì)NB細(xì)胞有抑制作用（圖2）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mir－181c在NB細(xì)胞中的新型調(diào)控機(jī)制，證明mir－181c可能在NB發(fā)病機(jī)制中起重要作用。相比之下，本研究組織標(biāo)本中RT－PCR 結(jié)果顯示，mir－181c在轉(zhuǎn)移NB組織中的表達(dá)率明顯低于原發(fā)NB組織，初步肯定mir－181c與NB轉(zhuǎn)移有關(guān)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染mir－181c－mmic可抑制NB細(xì)胞的遷移和侵襲分別約40%和50%（圖3），確定本實(shí)驗(yàn)中mir－181c是抑癌基因。

［1］ Sharp SE，Gelfand MJ，Shulkin BL.Pediatrics：diagnosis of neuroblastoma［J］.Semin Nucl Med，2011，41（5）：345－353.

［2］ Qiao J，Lee S，Paul P，et al.Akt2regulates metastatic potential in neuroblastoma［J］.PloS One，2013，8（2）：e56 382.

［3］ Brodeur GM，Seeger RC，Schwab M，et al.Amplification of N－myc in untreated human neuroblastomas correlates with advanced disease stage［J］.Science，1984，224（4653）：1 121－1 124.

［4］ Ambros V.The functions of animal miRNAs［J］.Nature，2004，431（7006）：350－355.

［5］ Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et al.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（9）：2 999－3 004.

［6］ Friedman RC，F(xiàn)arh KK，Burge CB，et al.Most mammalian mRNAs are conserved targets of miRNAs［J］.Genome Res，2009，19（1）：92－105.

［7］ Xu N，Zhang L，Meisgen F，et al.MiRNA－125bdown－regulates matrix metallopeptidase 13and inhibits cutaneous squamous cell carcinoma cell proliferation，migration，and invasion［J］.J Biol Chem，2012，287（35）：29 899－29 908.

［8］ Zhang LY，Liu M，Li X，et al.MiR－490－3p modulates cell growth and epithelial to mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma cells by targeting endoplasmic reticulum－Golgi intermediate compartment protein 3＊（ERGIC3）［J］.J Biol Chem，2013，288（6）：4 035－4 047.

［9］ Zhang Y，Yan LX，Wu QN，et al.miR－125bis methylated and functions as a tumor suppressor by regulating the ETS1 proto－oncogene in human invasive breast cancer［J］.Cancer Res，2011，71（10）：3 552－3 562.

［10］ Guo J，Dong Q，F(xiàn)ang Z，et al.Identification of miRNAs that are associated with tumor metastasis in neuroblastoma［J］.Cancer Biol Ther，2010，9（6）：446－452.

［11］ Terrile M，Bryan K，Vaughan L，et al.miRNA expression profiling of the murine TH－MYCN 10neuroblastoma model reveals similarities with human tumors and identifies novel candidate miRNAs［J］.PloS One，2011，6（12）：e28356.

［12］ Lynch J，F(xiàn)ay J，Meehan M，et al.MiRNA－335suppresses neuroblastoma cell invasiveness by direct targeting of multiple genes from the non－canonical TGF－beta signalling pathway［J］.Carcinogenesis，2012，33（5）：976－985.

［13］ Zhang H，Qi M，Li S，et al.miRNA－9targets matrix metalloproteinase 14to inhibit invasion，metastasis，and angiogenesis of neuroblastoma cells［J］.Mol Cancer Ther，2012，11（7）：1 454－1 466.

［14］ Chio CC，Lin JW，Cheng HA，et al.MiRNA－210targets antiapoptotic Bcl－2expression and mediates hypoxia－induced apoptosis of neuroblastoma cells［J］.Arch Toxicol，2013，87（3）：459－468.

［15］ Xin C，Buhe B，Hongting L，et al.MiRNA－15apromotes neuroblastoma migration by targeting reversion inducing cysteine－rich protein with Kazal motifs（RECK）and regulating matrix metalloproteinase－9expression［J］.FEBS J，2013，280（3）：855－866.

［16］ Ji J，Yamashita T，Budhu A，et al.Identification of miRNA－181by genome－wide screening as a critical player in EpCAMpositive hepatic cancer stem cells［J］.Hepatology，2009，50（2）：472－480.

［17］ Wang B，Hsu SH，Majumder S，et al.TGFbeta－mediated upregulation of hepatic miR－181b promotes hepatocarcinogenesis by targeting TIMP3［J］.Oncogene，2010，29（12）：1 787－1 797.

［18］ Li J，Cao Y，Ma XJ，et al.Roles of miR－1－1and mir－181cin ventricular septal defects［J］.Int J Cardiol，2013，168（2）：1 441－1 446.

［19］ Cui M，Yue L，F(xiàn)u Y，et al.Association of MiRNA－181cExpression with the Progression and Prognosis of Human Gastric Carcinoma［J］.Hepatogastroenterology，2013，60（125）：961－964.

［20］ Rio P，Agirre X，Garate L，et al.Down－regulated expression of hsa－mir－181cin Fanconi anemia patients：implications in TNFalpha regulation and proliferation of hematopoietic progenitor cells［J］.Blood，2012，119（13）：3 042－3 049.