一種大鼠心肌缺血模型的制作方法

呂沛然等

【摘要】目的：建立一種大鼠心肌缺血模型制作方法，保證模型制作的準(zhǔn)確程度與術(shù)后大鼠存活率。方法：大鼠麻醉后，先行明視經(jīng)口氣管插管，呼吸機(jī)供給氧氣；次行開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支術(shù)；再行肺復(fù)張術(shù)；另術(shù)前及術(shù)后三天予以抗生素注射與體溫支持等措施。結(jié)果：經(jīng)過改進(jìn)，造模準(zhǔn)確率達(dá)到100%，術(shù)后四周存活率達(dá)到 80%。結(jié)論：控制結(jié)扎位置可提高模型準(zhǔn)確率，術(shù)中供給氧氣可提高大鼠存活率。

【關(guān)鍵詞】心肌缺血；動(dòng)物模型；大鼠；氧氣；冠狀動(dòng)脈左前降支

【中圖分類號(hào)】R-332；R542.22 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2015）02-0693-02

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：81373561）

在心肌缺血（MI）動(dòng)物模型制作中，SD大鼠是常用動(dòng)物[1]，行結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）手術(shù)是傳統(tǒng)造模方法。如何準(zhǔn)確客觀模擬心肌缺血的病理改變且提高大鼠術(shù)后存活率是模型制作的關(guān)鍵。本研究課題組立足于本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際并參考眾多研究者經(jīng)驗(yàn)[2、3]，建立了一種大鼠心肌缺血模型的制作方法，以期達(dá)到保證模型成功率與大鼠術(shù)后存活率的目的。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，20只，雌雄各半，2～4 月齡，體重250±30g，由四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所中心提供（許可證號(hào)：SCXK（川）2013-15）。動(dòng)物在手術(shù)操作前適應(yīng)飼養(yǎng)一周，飼養(yǎng)環(huán)境為自然光暗周期，溫度23～26℃、相對(duì)濕度40%～70%，雌雄分開，5只/籠，自由飲水進(jìn)食。

1.1.2手術(shù)器械及耗材

顯微持針鉗，開瞼器，7-0顯微帶線縫合針，4-0縫合線，○ 1/2 4×12醫(yī)用逢合針，24G靜脈留置針，鐵絲，常規(guī)手術(shù)器械與耗材。

1.1.3藥物

水合氯醛、0.9%氯化鈉注射液，注射用青霉素鈉，碘伏、75%乙醇，PBS磷酸鹽緩沖液、TTC染色液。

1.1.4儀器設(shè)備

肯特Kent PhysioSuite （Monitor for Mice and Rats） ，氧氣袋，CMA/450動(dòng)物恒溫控制器，BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，自制鼠臺(tái)，強(qiáng)光手電筒。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1麻醉

7%水合氯醛氯化鈉溶液以280mg/kg（0.4ml/100g）比例對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，再腹腔注射青霉素8萬U預(yù)防感染，然后將其仰臥位固定于鼠臺(tái)上，前胸部備皮，碘伏消毒。

1.2.2氣管插管及呼吸機(jī)設(shè)置

采用明視經(jīng)口氣管插管的方法，并通過呼吸機(jī)供給醫(yī)用氧氣。

氣管插管。將24G靜脈留置針剪去前端留約5 cm軟管，插入細(xì)鐵絲，醫(yī)用棉簽擦拭其口腔，術(shù)者一手向外上方提起大鼠舌頭，另一手持留置針，助手持手電筒照射其頸部，術(shù)者經(jīng)口腔觀察到大鼠的聲門襞隨著呼吸節(jié)律開合，將留置針抵在氣管口，當(dāng)聲門襞打開時(shí)順勢(shì)將留置針推入氣管，手下有留置針向前推進(jìn)時(shí)與環(huán)狀軟骨相碰撞的頓挫感，退出鐵絲，置一絲棉絮留置針口，若其隨呼吸被吹動(dòng)可確定插管成功。

呼吸機(jī)設(shè)置。將留置針與肯特Kent PhysioSuite相連。其進(jìn)氣口連接氧氣袋，供給氧氣。根據(jù)大鼠體重設(shè)置相關(guān)呼吸輔助參數(shù)，儀器自動(dòng)設(shè)置呼吸頻率，范圍在65～81次/分，手動(dòng)設(shè)置潮氣量，比例為1ml/100g體重，吸呼比1：1，嘆息通氣比為1：60。

1.2.3開胸手術(shù)及結(jié)扎

連接BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)并記錄手術(shù)過程中心電圖的變化。開胸手術(shù)：雌鼠于左側(cè)胸部第二與第三乳頭間中上三分之一處，垂直前正中線剪開皮膚2～2.5 cm（雄鼠剪開皮膚位置參考對(duì)比雌鼠），常規(guī)鈍性分離筋膜層與肌肉層，暴露肋層。于第三肋間靠近胸骨處，止血鉗迅速穿破肋間肌，沿肋間橫向分離肌肉約1～1.5 cm，放入開瞼器，撐開第四肋間，充分暴露視野。

結(jié)扎LAD。撕破心包膜，暴露左心耳與肺動(dòng)脈圓錐，可察及暗紅色的為左冠狀靜脈主干，冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）與之緊密伴行。以左心耳、肺動(dòng)脈圓錐與左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，在其下緣連線下方約2 mm處確定冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）位置，7-0顯微帶線縫合針垂直于左冠狀靜脈主干約2 mm進(jìn)針，深度約1～1.5 mm，寬度約3～4 mm，于其冠狀靜脈主干另一側(cè)約2mm處出針，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）。結(jié)扎后，肉眼可觀察到結(jié)扎位置及以下冠狀動(dòng)脈左前降支供血區(qū)心肌變白，心電圖中ST段抬高。

1.2.4關(guān)胸

撤下開瞼器，縫合肋間。肋間縫合完畢后，術(shù)者在由兩側(cè)向中間擠壓大鼠胸腔的同時(shí)，助手堵住呼吸機(jī)的出氣口，約2～3 秒，助大鼠肺復(fù)張，刺激其自主呼吸，并恢復(fù)胸腔負(fù)壓。常規(guī)縫合肌肉層與皮膚，可重復(fù)擠壓胸腔的操作。

縫合完畢，觀察大鼠的呼吸情況，若其自主呼吸明顯，試停呼吸機(jī)，待到大鼠呼吸平穩(wěn)即可撤下呼吸機(jī)。

1.2.5 術(shù)后護(hù)理

將大鼠以右側(cè)臥位置于鋪好干凈墊料的鼠籠中，單籠飼養(yǎng)。

未蘇醒時(shí)，要對(duì)大鼠進(jìn)行保暖以防其體溫過低死亡。術(shù)后約1.5～2h后，大鼠或有翻身掙扎，此時(shí)可用注射器向其口角滴飲用水，一般情況下大鼠就會(huì)主動(dòng)飲水，既補(bǔ)充液體，又刺激其蘇醒。術(shù)后連續(xù)3天每天腹腔注射青霉素8萬U，每天更換墊料、供給飲用水與新鮮飼料。

2結(jié)果

2.1模型成功標(biāo)準(zhǔn)

造模成功與否可由結(jié)扎LAD后心電圖的變化與心肌顏色的變化進(jìn)行判定，還可以有一些手術(shù)后大鼠行為學(xué)的改變作為參考，并做心臟切片TTC染色加以確認(rèn)。

2.1.1術(shù)中心肌顏色與心電圖改變

結(jié)扎LAD后，可觀察到結(jié)扎位置及以下心肌變白，提示結(jié)扎到位。

正常心電圖、結(jié)扎后心電圖如圖1、圖2，結(jié)扎后可明顯觀察到S-T段的改變[4]，提示結(jié)扎到冠狀動(dòng)脈左前降支，造模成功。

箭頭所示，結(jié)扎后S-T段抬高。

2.1.2大鼠行為學(xué)改變

術(shù)后飼養(yǎng)時(shí)可觀察到大鼠背毛乍起，常呈弓背體位[5]，且進(jìn)水、飲食等活動(dòng)減少。

2.1.3心肌TTC染色

術(shù)后第四周末，由股靜脈注射適量10% KCL處死大鼠，打開胸腔迅速取出心臟，剪去多余組織，4℃生理鹽水沖凈瘀血，-20℃冷凍2小時(shí)后，由心尖向結(jié)扎位置垂直心臟長(zhǎng)軸做2～3 mm切片，置于適量0.1%TTC溶液中37℃溫育5min左右，結(jié)果如圖3，結(jié)扎位置以下缺血區(qū)心肌為白色。

箭頭所示，結(jié)扎位置及以下缺血區(qū)心肌染色結(jié)果為白色。

2.2 大鼠術(shù)后成活率

共計(jì)20只大鼠，4只術(shù)后撤下呼吸機(jī)后死亡，余16只成活至術(shù)后第四周末，成活率80%。

結(jié)論

一個(gè)穩(wěn)定且可復(fù)制的動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究開展的基礎(chǔ)，在大鼠心肌缺血模型的制作中有很多細(xì)節(jié)需要把握，經(jīng)過反復(fù)的手術(shù)操作練習(xí)，才能保證模型的準(zhǔn)確與穩(wěn)定。

參考文獻(xiàn)

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