免疫性壞死性肌病肌肉組織抗SRP19抗體表達的研究

汪茜 蒲傳強

【摘要】目的：探索抗SRP19抗體在免疫性壞死性肌病患者肌肉組織表達的作用。方法：采用免疫組織化學染色方法，觀察抗SRP19抗體在免疫性壞死性肌病患者肌肉組織中的表達并與相關臨床資料進行統計分析。結果：71.43%（20/28）的免疫性壞死性肌病患者肌肉組織中抗SRP19抗體表達陽性，主要表達在壞變肌纖維胞漿、小血管周圍及細胞間質中。與不表達者比較，在年齡、病程、肌力以及肌酸激酶等方面無顯著性差異（P=0.202，0.939，0.711，0.109，P>0.05）其血清抗核抗體、抗Ro-52、抗SSA、抗Sm、抗Jo-1表達也無顯著性差異（P=0.281，1.000，0.497，1.000，1.000，P>0.05）。結論：抗SRP19抗體在免疫性壞死性肌病患者肌肉組織的表達率較高，可能參與疾病的發生與發展過程。

【關鍵詞】免疫性壞死性肌病；免疫組織化學；抗信號識別顆粒抗體

【中圖分類號】R741.02【文獻標識碼】B【文章編號】1005-0019（2015）01-0518-01

基金項目：

1.首都臨床特色應用研究，題目：肌肉酶組織化學和免疫分子病理技術在肌病診斷中的規范應用研究，編號：Z111107058811108

2.北京市自然科學基金，題目：基于全外顯組測序技術的中國遺傳性包涵體肌病家系致病基因定位及遺傳性分析，編號：7132216

3.國家自然科學基金，題目：遺傳性包涵體肌病候選基因篩查及新致病基因定位研究，編號：81271399

壞死性肌病（necrotizingmyopathy，NM）是以肌纖維變性和壞死，不伴或極少伴有炎性細胞浸潤為主要病理特征的特發性炎性肌病[1]，是不同于多肌炎、皮肌炎、包涵體肌炎及非特異性肌炎的新亞型。常與腫瘤、病毒感染、肌毒性藥物及結締組織病相關，也有一類在確診前后均未找到相關繼發原因的病例，稱之為免疫性壞死性肌病。自2002年Miller[2]發現7例NM患者血清中存在抗信號識別顆粒（signalrecognitionparticle，SRP）抗體以來，SRP表達與壞死性肌病致病機制的關系就成了這個領域研究的熱點，甚至有學者提出SRP可以作為NM的標志[3]，NM因起病急、進展快、致殘率高、早期有可治性而備受關注，但以往的研究只關注患者血清中的抗SRP19抗體表達，而極少研究免疫性壞死性肌病的肌肉組織中是否有表達，與發病有何關系。因此，為了進一步探索抗SRP抗體在免疫性壞死性肌病發病機制中的作用，我們擬觀察免疫性壞死性肌病患者肌肉組織是否存在抗SRP19抗體的表達。

1.材料與方法

1.1入選病例：選取2008年1月至2011年10月期間，因肌無力、肌痛在我院就診，伴有血清肌酶升高和肌電圖為肌源性受損，肌肉病理表現為典型的廣泛或片狀肌纖維壞死而沒有明顯的炎性細胞浸潤，激素和免疫抑制治療有效的28例病例。所選病例均排除腫瘤、藥物等其他繼發性因素，均經酶組織化學和免疫組化染色排除常見類型肌營養不良、先天性肌病。

1.2診斷標準：符合2004年歐洲神經肌肉疾病中心和美國肌肉研究協作組（ENMC）提出的IIM分類診斷中免疫性壞死性肌病的診斷標準[1]，①常>18歲發病，亞急性或隱匿性起病，對稱性肌無力，近端重于遠端，累及頸部肌群時，屈肌受累重于伸肌；②肌酸激酶CK異常升高；③肌電圖呈肌源性損害，或肌肉組織核磁共振MRI成像STIR顯示彌漫或片狀信號增強，或血清學化驗肌炎特異性抗體陽性，三者存在其一；④病理學檢查突出表現為可見大量肌纖維壞死，而炎性細胞不明顯或只有少數散布在小血管周圍，肌束膜浸潤不明顯。

1.3抗體：兔抗人抗SRP19多克隆抗體（ab50932）100ug，abcam公司；通用型兩步法免疫組化檢測試劑盒（PV-9000），北京中杉金橋生物制品公司：二抗試劑A為聚合物增強劑（即用型），二抗試劑B為酶標抗鼠/兔聚合物（即用型）；DAB顯色劑，北京中杉金橋生物制品公司。

1.3方法：

1.3.1臨床資料收集：28例免疫性壞死性肌病病例均仔細采集相關資料，包括患者年齡、性別、病程、起病形式、臨床癥狀、家族史及個人史、臨床體征、血清肌酶、免疫學指標、肌電圖、肌肉病理活檢、激素和免疫抑制劑治療效果等。

1.3.2肌肉病理檢查：經患者同意并簽署知情同意書后進行肌肉活檢，主要部位為肱二頭肌和股四頭肌。肌肉獲取后放入液氮速凍，次日進行冰凍切片，分別進行HE、MGT、ORO、NADH、SDH、ACP、PAS、NSE、ATP酶、dystroglycan、sarcoglycan、dystrophin、dysferlin以及MHC-1等染色，由肌肉病理專家觀察肌肉組織形態學改變并進行記錄和照相。

1.3.3肌肉組織抗SRP19抗體免疫組織化學染色：28例患者的肌肉組織標本分別進行抗SRP19抗體染色，染色方法如下：（1）將干燥切片用3%H2O2，37℃孵育10min，以阻斷內源性過氧化酶，PBS洗，5min×3遍；（2）滴加稀釋好的一抗，一抗為抗SRP19抗體（1：125；Abcam），37℃孵育60min，PBS洗，5min×3遍；（3）滴加山羊血清，37℃孵育20min，以封閉非特異性位點；（4）滴加二抗試劑A（聚合物增強劑），37℃孵育20min，PBS洗，5min×3遍；（5）滴加二抗試劑B（辣根酶標試劑：山羊抗兔/鼠聚合物），37℃孵育30min，PBS洗，5min×3遍；（6）新鮮配制的DAB顯色液，在室溫下顯色2-3min，據顯色程度控制反應時間，充分水洗、復染、脫水、透明、封片。判斷標準：光鏡觀察：抗SRP19抗體陽性反應為壞死肌纖維胞漿呈棕黃色，根據染色與否分為陽性和陰性：陰性：胞漿不著色；陽性：胞漿呈淡黃色、黃色或棕色。

1.4統計：統計分析由SPSS17.0統計軟件包完成。計量資料用均數±標準差和中位數表示，計數資料用頻數和百分比表示，計量資料對比用T檢驗，P<0.05為統計學顯著性標準。

2.結果

2.1臨床資料：28例患者中，男14例，女14例，男：女=1：1，發病年齡15-67歲，平均年齡（42.39±15.26），細化年齡分組，可觀察到51-60的年齡發病高峰以及可疑潛在的31-40歲年齡發病高峰，分別占32.14%和21.43%。51-60歲組中發病者9人，男：女=8：1，有明顯的男性患病優勢，但整體觀察無性別優勢（P=0.556>0.05）。肌電圖均呈肌源性損害。血清肌酶明顯升高，CK均值6329.86±5351.78（108.4-27036mmol/L）；LDH均值932.33±549.34（174-2374mmol/L）。患者均經激素及免疫抑制治療，對比治療前后患者血清肌酶值及肌力變化（表1），肌酸激酶CK下降有顯著統計學差異（P﹤0.001），肌力改善不明顯，無統計學差異（P=0.823>0.05）。

表1壞死性肌病患者治療前后肌酶及肌力變化

指標 例數 治療前 治療后 PCK 28 6329.86±5351.78 1287.15±1042.12 0.000**肌力 28 3.14±1.06 3.16±1.14 0.823治療前后選擇配對T檢驗，**為P≤0.001，有顯著統計學差異。

2.2肌肉組織抗SRP19抗體免疫組織化學染色結果：抗SRP19抗體主要表達在壞變肌纖維胞漿（圖1）、小血管周圍及細胞間質中（圖2），非壞死性肌纖維中亦有部分表達。28例患者肌肉病理標本抗SRP19抗體染色，20例陽性（20/28，71.43%），8例陰性（8/28，28.57%）。

圖1肌肉組織免疫組化染色顯示壞死肌纖維出現抗SRP19抗體明顯表達。X200

圖2肌肉組織免疫組化染色顯示肌纖維間隙滲出的炎性細胞抗SRP19抗體明顯表達。X200

2.3抗SRP19抗體染色陽性/陰性患者臨床特點分析：依抗SRP19抗體染色結果，將表達與不表達的患者分為兩組并進行相關臨床資料的統計分析，結果發現：抗SRP19抗體的是否表達與患者的性別、年齡、病程、肌力和肌酸激酶均沒有顯著的差別（表2）。28名患者中，6名（6/28，21.4%）患者檢查出ENA抗體譜陽性，檢測出的抗體為抗核抗體（n=5）、抗Ro-52（n=2）、抗SSA（n=1）、抗SSm（n=1）、抗Jo-1（n=1），5名（5/28，17.9%）患者呈現多抗體陽性。統計分析提示抗SRP19抗體的表達與血清抗核抗體、抗Ro-52抗體、抗SSA抗體、抗SSm抗體、抗Jo-1抗體沒有顯著關系（表3）。

3.討論

壞死性肌病是一種以肌纖維呈明顯變性壞死，且不伴有炎性細胞浸潤為主要病理特征的肌病，依病因可分為繼發性和免疫性，前者由惡性腫瘤、中毒、藥物等多種原因引起；后者多不能找到原因，因對腎上腺皮質激素和免疫抑制治療有效，被認為是免疫介導的發病機制致病，因此，后者也稱為免疫性壞死性肌病。關于免疫性壞死性肌病的相關研究并不多，我們以前曾報道過[3]，免疫性壞死性肌病患者肌肉組織的壞死肌纖維和小血管出現明顯的C5b-9沉積，但這只是一種非特異性免疫物質在壞變肌纖維的表達，其根本原因仍然不清。近年來，人們發現壞死性肌病肌病患者血清中存在著抗SRP抗體，為研究免疫性壞死性肌病發病機制和潛在的治療方案提出新的思路。

SRP作為肌炎特異性自身抗體（MSAS）之一，可通過抗SRP54、72、19亞單位抗體和抗7SLRNA抗體進行檢測。迄今為止，國內外研究關注的都是血清中SRP的表達[4]，發現血清中抗SRP抗體與免疫性壞死性肌病密切相關，對于肌肉組織中是否存在抗SRP抗體，又如何參與免疫發病機制尚未見報道。免疫性壞死性肌病的靶器官損害在骨骼肌，通過研究肌肉組織中抗SRP19抗體表達，將有助于人們加深對SRP相關免疫性壞死性肌病的認識。研究報道SRP相關免疫性壞死性肌病的平均發病年齡在50歲，與我們觀察到患者發病存在51-60歲的發病高峰一致。

抗SRP抗體在特發性炎性肌病患者血清中的陽性率不完全一致，一般認為在4%-6%，也有報道[5]其在PM中的陽性率為11.9%。我們檢測免疫性壞死性肌病患者肌肉組織中的抗SRP19抗體，結果發現本組患者肌肉組織中抗SRP19抗體陽性率高達71.43%，IIM患者患者血清抗SRP抗體陽性率較低，可能是此種類型IIM發病率較低有關；但也可能是限于血清學樣本檢測之故；也許進行IIM患者肌肉組織抗SRP抗體檢測，其陽性率會更高。我們發現，抗SRP抗體主要表達在壞變肌纖維胞漿，小血管周圍和細胞間質中，非壞死性肌纖維中也有部分表達，提示壞死肌纖維直接受到抗SRP19抗體攻擊而致病。受樣本條件所限，本研究未能同時檢測血清、肌肉組織SRP19抗體表達，但本研究的目的主要是觀察肌肉組織中SRP19的表達，以進一步證實SRP19是否參與肌細胞壞死過程，進而探討SRP相關免疫性壞死性肌病的發病機制。

本研究還發現，免疫性壞死性肌病患者肌肉組織抗SRP19抗體的表達與患者的性別、年齡、病程、肌力、肌酶及其他肌炎相關抗體沒有明顯的關系，提示SRP在免疫性壞死性肌病發生中具有獨特性作用。2011年BenvenisteO[6]對8例抗SRP抗體陽性患者在激素及免疫抑制治療前后進行血清中抗SRP抗體進行定量測定，發現患者血清中CK和抗SRP定量隨治療前后癥狀的減輕而下降；近期有研究證實[7]，隨癥狀的好轉，在壞死性肌病的緩解期，抗SRP抗體可完全降至正常水平，證實SRP可能是免疫性壞死性肌病的獨立危險因素，在疾病的發展及轉歸中起重要作用的推斷。

相對于其他IIM患者，單純腎上腺皮質激素治療NM效果較差，需聯用免疫抑制劑方可達到相對滿意的療效。我們發現免疫性壞死性肌病患者經腎上腺皮質激素及免疫抑制聯合治療后，血清肌酸激酶明顯下降，肌力改善卻不明顯。血清肌酸激酶在治療后快速下降，說明免疫抑制治療可以遏制病情的進展，挽救瀕死肌細胞，中止肌細胞進入壞死途徑。肌力無明顯改善可能與壞死是細胞周期的終末階段及肌細胞再生能力較差有關。針對抗SRP抗體相關免疫性壞死性肌病發病機制進行深入研究，可為探索更有效的治療手段提供新的基礎。

參考文獻

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[6]BenvenisteO，SchmidtJ.Diagnosis，pathogenesisandtreatmentofmyositis：recentadvances[J].ClinExpImmunol，2014，175（3）：349-358

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