葛根素對中波紫外線損傷HaCaT細胞的抗氧化作用*

黃綿慶，楊照新，姚茂忠，田樹紅，符 健

(海南醫學院，海口 571101)

葛根素(puerarin)是從豆科植物野葛(pueraria lobata)的干燥根中提取的主要有效成分，其化學名稱為8-β-D-葡萄吡喃糖-4′，7-二羥基異黃酮，臨床上主要用于冠心病、各型心絞痛、心肌梗死、視網膜動、靜脈阻塞及突發性耳聾的治療。葛根素在體外有良好的清除氧自由基的能力[1-2]，其抗氧化作用是保護急性缺血心肌細胞的重要機制之一[3]。為了深入研究葛根素是否對氧化損傷的上皮細胞也具有保護作用，作者以人角質形成細胞(HaCaT細胞)建立中波紫外線(ultraviolet B，UVB)氧化損傷模型，研究葛根素不同處理方式對HaCaT細胞抗氧化指標的影響。

1 材料與方法

1.1細胞株 HaCaT細胞株，購自中科院昆明細胞庫。

1.2儀器與試劑 MCO-15AC二氧化碳培養箱為日本三洋公司產品，MK3型酶標儀為上海賽默飛世爾儀器有限公司產品，流式細胞儀為美國Becton Dickison公司產品，紫外線測量儀為臺灣先馳光電股份有限公司產品，葛根素為華北制藥集團制劑有限公司產品，活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒為江蘇碧云天生物技術研究所產品，超氧化物歧化酶(super oxidative dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPH-Px)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產品。

1.3方法

1.3.1HaCaT細胞培養 HaCaT細胞以DMEM培養，置于37 ℃和5%CO2的細胞培養箱環境生長。細胞融合至80%以上，傾去瓶中培養液，以0.05%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化細胞，1 000 r/min離心5 min后去上清液，加入培養液調整細胞濃度為5×104/mL，將HaCaT細胞接種到6孔培養板生長，取指數生長期細胞進行實驗。

1.3.2HaCaT細胞分組和處理 實驗設5個組，分別為陰性對照組、模型組、UVB照射前給藥組、UVB照射后給藥組和UVB照射前后給藥組。細胞生長融合至80%時，UVB照射前給藥組細胞以1.0 mg/mL葛根素孵育1 h，棄上清液后以30 mJ/cm2UVB直接照射細胞；UVB照射后給藥組細胞在UVB照射后以1.0 mg/mL葛根素處理1 h；UVB照射前后給藥組細胞在UVB射前后各以1.0 mg/mL葛根素處理1 h。選擇1.0 mg/mL葛根素濃度，是因為課題組先前研究結果顯示該濃度葛根素對HaCaT細胞無細胞毒性，并且對UVB誘導的HaCaT細胞凋亡抑制作用最佳[4]。陰性對照組不接收藥物和UVB處理，模型組細胞只接受UVB照射。各處理組細胞在UVB射后24 h進行指標檢查。

1.3.3檢測細胞內ROS UVB照射后24 h，細胞消化和離心，以4 ℃磷酸緩沖液洗滌2次，調節細胞濃度為1×106/mL，按照ROS檢測試劑盒裝載DCFH-DA熒光探針，以流式細胞儀檢測每萬個細胞的平均熒光強度，激發波長為488 nm，熒光強度代表細胞內ROS水平。

1.3.4檢測細胞內抗氧化指標 細胞在UVB照射后24 h消化洗滌，調節細胞濃度為1×107/mL，在0 ℃制備細胞勻漿，離心后將細胞上清液轉移至干凈試管，按照各試劑盒說明書檢測T-AOC、MDA、SOD、CAT、GSH-Px水平。

2 結 果

2.1葛根素對HaCaT細胞內ROS水平的影響 照射UVB的HaCaT細胞內ROS水平顯著升高，給予葛根素處理后ROS水平均下降，見圖1。

2.2葛根素對HaCaT細胞內T-AOC和MDA水平的影響 與陰性對照組相比，模型組T-AOC水平明顯下降，而MDA水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，UVB照射前給藥組與UVB照射前后給藥組HaCaT細胞內T-AOC水平下降，而MDA水平上升，差異有統計學意義(P<0.05)；UVB照射后給藥組HaCaT細胞內T-AOC和MDA水平與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 葛根素對HaCaT細胞內T-AOC和MDA水平的影響

##：P<0.01，與陰性對照組比較；*：P< 0.05，**：P<0.01，與模型組比較。

2.3葛根素對HaCaT細胞內SOD、CAT、GSH-Px水平的影響 與陰性對照組比較，模型組細胞內SOD、CAT、GSH-Px水平均明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，UVB照射前給藥組和UVB照射前后給藥組細胞內SOD、CAT、GSH-Px水平均上升(P<0.05)；UVB照射后給藥組細胞內SOD水平上升(P<0.05)，但CAT和GSH-Px水平無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 葛根素對HaCaT細胞內SOD、CAT、GSH-Px水平的影響

##：P< 0.01，與陰性對照組比較；*：P< 0.05，**：P< 0.01，與模型組比較。

##：P<0.01，與陰性對照組比較；**：P<0.01，與模型組比較。

3 討 論

陽光紫外線根據波長分為UVA、UVB和UVC，UVB雖然只占其中4%，但對皮膚曬傷和皮膚癌的形成起主要作用。首先，UVB可被皮膚角質形成細胞DNA吸收，直接導致DNA損傷、癌基因和抑癌基因突變。其次，UVB可觸發光氧化反應，增加細胞內ROS。ROS水平超過細胞抗氧化系統防御能力引起細胞損傷[5-6]。因此針對UVB的抗氧化劑一直是這一領域的熱點。葛根素藥用制劑從2003年起被SFDA批準注冊，主要作為心血管治療藥物使用。雖然葛根素在心腦血管病治療中顯示抗氧化作用，但是尚未有抗紫外線氧化損傷的研究報道。

有關葛根素的大多數研究顯示，葛根素能直接清除氧自由基，對多種細胞損傷具有保護作用，可減輕缺血-再灌注引起的心肌細胞、胰島細胞、肝細胞和神經細胞損傷，此外對糖尿病胰腺細胞、乙醇中毒肝細胞和阿爾茨海默病神經細胞也有很好的保護作用[3,7-13]。在抗氧化機理方面，Zhao等[14]研究顯示葛根素提高乙醇損傷大鼠肝臟內SOD和GSH-Px水平，同時降低MDA水平；Wan等[15]發現葛根素可提高缺血-再灌注大鼠腦組織SOD水平并降低MDA水平。與此一致的是，本文無論預防性還是治療性葛根素處理，均不同程度增加UVB照射細胞相關抗氧化指標和減少ROS水平。相比之下，UVB照射前后均給葛根素增加細胞內SOD、CAT和GSH-Px水平的效果更佳，而UVB照射后給葛根素處理除了增加細胞內SOD水平外，對其他指標均無影響。這表明葛根素不同處理方式影響其抗氧化能力，其中預防性結合治療性處理效果最佳，單純預防性處理其次，單純治療性處理最差。

[1]鄺棗園，吳偉，葛根素，等.川芎嗪注射液對羥自由基水平的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，1998，

9(2)：92-93.

[2]朱慶磊，呂欣然，何愛霞.葛根素對氧自由基的清除和抗氧化性損傷作用[J].解放軍藥學學報，2001，17(1)：1-3.

[3]盧金萍，任江華，姜黎.葛根素對心肌缺血-再灌注損傷能量代謝的影響[J].山東中醫雜志，2009，28(12)：867-868.

[4]黃綿慶，楊照新，姚茂忠，等.預防性葛根素抑制UVB誘導的HaCaT細胞凋亡[J].中國熱帶醫學，2011，11(11)：1379-1380.

[5]Saitoh Y,Miyanishi A,Mizuno H,et al.Super-highly hydroxylated fullerene derivative protects human keratinocytes from UV-induced cell injuries together with the decreases in intracellular ROS Generation and DNA damages[J].J Photochem Photobiol B,2011,102(1):69-76.

[6]Afaq F,Zaid MA,Khan N,et al.Protective effect of pomegranate-derived products on UVB-mediated damage in human reconstituted skin[J].Exp Dermatol,2009,18(6):553-561.

[7]王嶸，蘇曉靈，周白麗.葛根素對兔心肌缺血-再灌注損傷時SOD、ANF含量的變化[J].青海醫學院學報，2005，26(2)：102-104.

[8]李衛東，劉順英.葛根素清除急性胰腺炎大鼠氧自由基作用的實驗研究[J].江蘇中醫藥，2007，39(1)：55-56.

[9]李濤，鄒志森.葛根素對大鼠肝缺血-再灌注損傷的保護作用[J].中藥藥理與臨床，2004，20(4)：15-16.

[10]王玉，朱慧淵，郭瑩，等.葛根素對局灶性腦缺血-再灌注模型大鼠腦組織水腫及神經細胞Na+-K+-ATPase,Ga2+-ATPase活性的影響[J].中國中醫急癥，2007，16(1)：70-71.

[11]曹莉，茅彩萍，顧振綸.葛根素對胰島素抵抗大鼠糖耐量及胰腺組織形態學的影響[J].中國血液流變學雜志，2008，18(1)：47-48,95.

[12]趙敏，杜艷秋，李長喻.葛根素對急性酒精中毒大鼠保護作用的實驗研究[J].中國現代醫學雜志，2006，16(17)：2610-2612,2615.

[13]張海英，胡海濤，劉亦恒，等.葛根素對Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡的影響[J].中藥材，2008，31(4)：543-546.

[14]Zhao M,Du YQ,Yuan L,et al.Protective effect of puerarin on acute alcoholic liver injury[J].Am J Chin Med,2010,38(2):241-249.

[15]Wan H,Zhu H,Tian M,et al.Protective effect of chuanxiongzine-puerarin in a rat model of transient middle cerebral artery occlusion-induced focal cerebral ischemia[J].Nucl Med Commun,2008,29(12):1113-1122.