定量蛋白質組學分析鏈霉素耐藥和敏感結核分枝桿菌臨床

分離株　孫艷蕾

【摘要】目的：研究分析敏感結核分枝桿菌鏈霉素耐藥相關的潛在菌體蛋白。方法：通過使用結核分枝桿菌臨床分析鏈霉素敏感株05和結核分枝桿菌H37Rv，并以其為對照，使用iTRAQ技術和生物信息學對結核分枝桿菌臨床分離株鏈霉素耐藥株08菌體蛋白進行鑒定和定量分析，并通過WeGo功能注釋聚類分析菌株的差異表達蛋白細胞組分和分析的功能以及其生物進程等內容。結果：08菌株分別與05菌株和H37Rv菌株比較差異表達為196個和138個，其中共同差異表達蛋白為119個。其中差異表達蛋白理論相對分子量的分布比較廣，其生物進程主要參與在中間代謝、脂質代謝以及呼吸作用中，其分子功能主要是催化活性和結合功能。其中共同差異表達蛋白分別為：8個核糖體蛋白在08菌株中表達下調、8個蛋白在08菌株中差異表達比較顯著。結論：使用iTRAQ技術可以有效的發展鏈霉素耐藥結核分枝桿菌相對于鏈霉素敏感結核分枝桿菌以及H37Rv菌株共同差異表達蛋白，可以為進一步研究結核分枝桿菌鏈霉素耐藥機制提供一定的依據和條件。

【關鍵詞】定量蛋白質組學分析；鏈霉素；耐藥；敏感結核分枝桿菌；臨床分離株

【中圖分類號】93A 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0181-02

根據研究發現，在結核疾病中，主要是耐多藥結核為主，因此，導致耐藥結核病的診斷和治療具有較大的困難。其中鏈霉素是一種氨基葡萄糖型的抗生素，對抗結核分枝桿菌具有一定的作用。目前針對結核病的治療主要是依靠利福平、鏈霉素、異煙肼等聯合化療，但是鏈霉素耐藥結核分枝桿菌普遍存在，導致在治療方面具有嚴重的影響[1]。通過定量蛋白質組學分析，可以全面的定量分析差異表達蛋白，為鑒定蛋白提供了較好的方式和手段。本研究通過對鏈霉素耐藥和敏感結核分枝桿菌臨床分離株進行定量蛋白質組學分析，現報告如下。

1.材料與方法

1.1一般材料

其一，菌株。結核分枝桿菌臨床分離鏈霉素敏感株05以及結核分枝桿菌臨床分離鏈霉素耐藥株08，用于抽提菌體蛋白的臨床分離株和H37Rv菌株主要是由國家結核病參比實驗室提供，菌體經鈷 60 照射滅活之后，保存在零下80攝氏度中以便備用。

其二，主要試劑和儀器。iTRAQ標試劑盒、胰蛋白酶、定量試劑盒，另外還包括半制備型HPLC、強陽離子交換柱和C18反相色譜柱等。

1.2方法

1.2.1全菌體蛋白的提取措施

滅活之后的結核分枝桿菌通過30分鐘洗滌，30分鐘離心處理，使用30ml的裂解液懸浮沉淀，同時使用高壓均質破碎儀器進行破菌處理，其中溶液的總體積要確保在50ml以內。通過四次循環破菌處理之后，再次進行30分鐘離心處理，并取20ml上清，加入5ml50%的TCA / 丙酮，使用冰水淋浴2小時，離心30分鐘之后使用零下20攝氏度的預冷丙酮洗滌沉淀物3次，并將其晾干處理。沉淀物就是菌體蛋白的樣品，將其放置在零下80℃以便備用。

1.2.2全菌體蛋白復溶及定量

將部分沉淀物放置在1.5ml的離心管中，并加入復溶Buffer ，最終濃度為1mmol / L。乙二胺四乙酸的最終濃度為2 m mol / L。將其混合均勻之后放置5分鐘，并加入二硫蘇糖醇，使得其最終濃度為10 m mol / L。并使用超聲助溶5分鐘，離心處理25分鐘，上清于56℃的水浴1小時之后取出，并迅速的加入碘乙酰胺，當最終濃度達到55-100 m mol / L之后，放置在暗室靜置1小時。之后加入4倍體積的預冷丙酮，放置在零下20℃的環境中沉淀3小時。離心處理之后棄上清。并使用300μL 的0. 1% SDS 的溶液和50%TEAB進行復溶沉淀，超聲助溶3分鐘，使用定量檢測總蛋白的提取量。

1.2.3蛋白質酶解

在每個樣品中取出100μg 的蛋白，并且使用0. 1%的SDS 溶液和50%的TEAB溶液補齊相同的體積。在每100μg 蛋白質的樣品中加入3.4μg 的胰蛋白酶，并放置在37攝氏度的水浴中，其放置時間為24小時。

1.2.4生物學分析

其中質譜數據通過相關軟件自動分析標峰，得出相關文件，并下載結核分枝桿菌的數據，將其作為搜索數據庫，通過搜索引擎進行本地搜索，對蛋白質鑒定進行評價打分。差異蛋白質的定量主要以搜庫的結果為前提基礎，根據軟件的加權方式，將08菌株分別與05菌株和H37Rv菌株相比，直接顯示相對定量結果，根據不同的鑒定次數進行分析研究，并通過WeGO功能注釋聚類分析差異蛋白細胞的組分、分子功能以及生物的進程等情況。

2.結果

2.1菌株的特點

05菌株是北京基因型，對鏈霉素、異煙肼以及利福平等藥物均具有一定的敏感想，08菌株是非北京基因型，只是對鏈霉素具有耐藥性。05菌株和08菌株的毒性相似，并且均高于標準菌株H37Rv。

2.2菌體蛋白鑒定和相對定量

通過鑒定的蛋白質數據進行統計分析，共鑒定到659個蛋白質，其中有意義的定量蛋白質為327個。08菌株分別與05菌株和H37Rv菌株比較差異表達為196個和138個，其中共同差異表達蛋白為119個。其中差異表達蛋白理論相對分子量的分布比較廣，其生物進程主要參與在中間代謝、脂質代謝以及呼吸作用中，其分子功能主要是催化活性功能和結合功能。其中共同差異表達蛋白分別為：8個核糖體蛋白在08菌株中表達下調、8個蛋白在08菌株中差異表達比較顯著。

3.討論

鏈霉素是一種抗結核藥物，通常和結核分枝桿菌核糖體蛋白質量共同作用于結核病，以便達到抑制其蛋白質合成的目的，從而取得較好的治療效果。本研究中通過使用iTRAQ技術對結核分枝桿菌進行分析研究，有效的克服了經典雙向凝膠電池存在的低分辨率和低敏感性的缺點，可以在任何類型的蛋白質中進行鑒定，并且可以同時定量8個以上的樣品，從而有效的縮小了不同樣品和不同批次間的實驗誤差，具有較好的重復作用[2]。

本研究中通過iTRAQ技術對結核分枝桿菌臨床分離鏈霉素耐藥株08、鏈霉素05敏感株以及標準株H37Rv進行定量蛋白質組學分析研究，對鏈霉素耐藥株08和鏈霉素05敏感株以及標準株H37Rv進行鑒定，共鑒定到共同差異表達蛋白119個，主要為代謝相關蛋白。

綜上所述，使用iTRAQ技術可以有效的發展鏈霉素耐藥結核分枝桿菌相對于鏈霉素敏感結核分枝桿菌以及H37Rv菌株共同差異表達蛋白，可以為進一步研究結核分枝桿菌鏈霉素耐藥機制提供一定的依據和條件。

參考文獻

[1]劉東.研究生蛋白質組學教學改革與實踐[J].現代醫藥衛生，2013（3）：15.

[2]朱傳智. 定量蛋白質組學分析鏈霉素耐藥和敏感結核分枝桿菌臨床分離株[J].微生物學報，2010（8）：147.