視網膜缺血再灌注損傷后凋亡相關基因表達的變化

馬書梅

【摘要】目的 研究視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）中凋亡相關基因野生型p53（WTp53）、bax和bcl-2表達的變化，探討其作用機制。方法將28只Wistar大鼠隨機分為正常組、缺血組，其中缺血組又分為再灌注后1、6、12、24、48和72 h等6個組。建立RIRI動物模型，用免疫組織化學鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）法檢測再灌注后不同時段視網膜組織中WTp53、bax和bcl-2基因表達的變化。結果 缺血組視網膜再灌注后WTp53、Bax蛋白表達增加，與正常組比較，再灌注6～72 h差異有顯著意義（ F=487.19、281.97，q=11.526～ 52.401 ，P lt；0.05）。缺血組視網膜再灌注后Bcl-2蛋白表達無明顯變化，與正常組比較，差異無顯著性（ P gt；0.05）。結論 缺血再灌注損傷引起WTp53、bax基因在視網膜神經節細胞層、神經纖維層與內核層表達增高；WTp53和bax可能通過誘導或促進神經節細胞凋亡參與了視網膜缺血再灌注損傷的發生。

【關鍵詞】 視網膜；再灌注損傷；基因，WTp53；基因，bax；基因，bcl-2；大鼠，Wistar

【中圖分類號】R774.1 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）03-0248-02

視網膜缺血再灌注損傷是眼科常見的病理過程，嚴重影響病人視功能。其發生機制十分復雜，已成為近年眼科的研究熱點之一。目前研究發現，視網膜缺血再灌注損傷中存在著神經細胞凋亡現象，且凋亡是視網膜神經細胞丟失的重要因素之一[1]。本實驗通過建立大鼠視網膜缺血再灌注損傷模型，研究凋亡相關基因野生型p53（WTp53）、bax和bcl-2的表達變化，探討視網膜缺血再灌注損傷的發生機制。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物及分組 健康無眼疾的Wistar大鼠（青島市實驗動物與動物實驗中心提供）28只，體質量250～300 g，雌雄不拘，室溫環境飼養。隨機分為兩組：正常組（4只）、缺血再灌注組（24只），其中缺 血再灌注組又分為再灌注后1、6、12、24、48和72 h等6個組，每組4只大鼠。

1.1.2主要試劑 兔抗大鼠WTp53、bax、bcl-2多抗（美國Santa Cruz生物技術公司生產），鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）免疫組化試劑盒（武漢Boster生物工程公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1動物模型的建立 采用前房穿刺加壓法建立大鼠缺血再灌注損傷模型，方法見文獻[2]。

1.2.2標本的取材、固定與切片 分別于再灌注后1、6、12、24、48、72 h處死動物，摘除眼球，制作石蠟切片，方法見文獻[2]。

1.2.3免疫組織化學染色 將標本的石蠟切片脫蠟至水，用蒸餾水新鮮配制體積分數0.03過氧化氫室溫放置10 min，以滅活內源性過氧化氫酶，復合消化液室溫浸浴10 min修復抗原，正常山羊血清室溫 10 min封 閉非特異性抗原，加一抗（兔抗大鼠WTp53、bax、bcl-2多抗） 37 ℃孵育2 h， 加二抗（生物素化山羊抗兔IgG）37 ℃水浴20 min，SABC法染色，DAB顯色，蘇木精輕度復染，脫水、透明、封片。

1.2.4結果觀察及數據處理 每只眼球取兩張切片進行分析，應用雙目光學顯微鏡（400倍）分別觀察WTp53、Bax、Bcl-2蛋白表達（陽性染色呈棕黃色）。應用圖像分析系統對免疫組化切片進行圖像分析（每張切片取4個視野，以視神經為基準分別向兩側各取2個視野），對視網膜組織中WTp53和Bax蛋白表達進行相對定量。

2 結果

2.1WTp53蛋白的表達變化 正常大鼠視網膜中幾乎無WTp53蛋白表達。WTp53蛋白于再灌注6 h開始在視網膜神經節細胞層少量表達，位于細胞核內，以后表達量逐漸增加，24 h達到高峰，此時除在神經節細胞層有強表達外，內核層也有散在的表達；48 h仍持續強表達； 72 h明 顯下降，但仍較正常組為高。再灌注6、12、24、48、72 h的WTp53蛋白陽性表達結果與正常組比較，差異有顯著性。見表1。

2.2 Bax蛋白的表達變化 正常大鼠視網膜中幾乎無Bax蛋白表達。Bax蛋白于再灌注6 h開始在視網膜神經節細胞層有表達，位于細胞漿中，以后表達量逐漸增加，24 h達到高峰，此時除在神經節細胞層有強表達外，內核層也有散在表達；48 h已有所下降，但仍表達較強；72 h明顯下降。再灌注6、12、24、48、72 h的Bax蛋白陽性表達結果與正常組比較，差異有顯著性。見表1。

2.3Bcl-2蛋白的表達變化 正常組視網膜Bcl-2蛋白低表達于神經節細胞層、神經纖維層及內核層。缺血再灌注后各時間段表達差異無顯著性。再灌注6、12、24、48、78 h的Bcl-2蛋白陽性表達結果與正常組比較，差異無顯著性（ P gt；0.05）。見表1。

表1 視網膜缺血再灌注后不同時段WTp53、Bax、Bcl-2蛋白的表達變化（略）

與正常組比較， F=487.19，281.97，* q=11.526～52.401， P lt； 0.05