膠質細胞源性神經營養因子基因克隆及表達載體的構建

孫曉晨　孫磊磊　李小東

【摘要】 目的：克隆大鼠膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）的全長基因，并構建真核細胞表達質粒。方法：運用已合成的GDNFcDNA，加入自行設計的引物擴增GDNF基因，并與質粒pEGFP-C3連接，構建表達質粒。結果：PCR擴增的目的基因為630bp，對構建的表達質粒雙切酶電泳及測序證明基因片段為630bp。 結論：正確克隆了GDNF基因并成功構建表達質粒，為下一步進行載體介導的體內轉基因奠定了基礎。

【關鍵詞】 膠質細胞源性神經營養因子； 載體； 克隆

【中圖分類號】R562.21 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0101-01

膠質細胞源性神經營養因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）是1993年Lin等從大鼠膠質瘤細胞B49中純化獲得的一種新型神經營養因子，化學結構為糖蛋白，并發現它具有促進多巴胺能神經元存活的功能[1] . Lin LFH，Doherty DH，Lile JD，et al.GDNF：a glial cell line-derived neurotrophic factor for midobrai dopaminergic neurons.[J].Science，1993，260（5111）：1130-1132]，后來進一步研究發現其對運功、感覺等多種神經元有營養作用。Oorschot等研究發現GDNF對培養的大鼠胚胎運動神經元存活具有重要作用，其效應分別是腦源性神經營養因子（BDNF）、睫狀神經營養因子（CNTF）和人類膽堿能分泌因子-白血病抑制因子（CDF/LIF）的75倍，650倍，和2500倍[2] Oorschot DE，Mclennan IS.The trophic requirements of mature motoneurons.[J].Brain Res，1998，789（2）：315-321]，Annette等發現GDNF在胚胎期可以促進感覺神經元軸突的發育，在成熟期可以促進軸突的延長[3] Annette Markus，Tushar D，Patel，William D.Snider. Neurotrophic factors and axonal growth[J].Curr Opin Neurobiol，2002，12（5）：523-53]。由于其對神經的營養作用，目前被應用到腦缺血，帕金森病等的研究中。后來，在研究疼痛的過程中，發現其對神經源性疼痛具有強烈的鎮痛與抑痛作用。但由于其在腦組織含量低，提取復雜，價格昂貴而限制了他的進一步引用。為此我們克隆了大鼠的GDNF基因，連于pcDNA3質粒，制備了帶有目的基因的真核細胞表達質粒，為下一步研究載體介導的GDNF質粒的治療作用打下基礎。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1GDNFcDNA菌種與質粒

鼠GDNFcDNA及質粒pEGFP-C3購自北京泛基諾公司。大腸桿菌JM109由西安交通大學遺傳學教研室提供。

1.1.2實驗試劑

限制性內切酶BamHI，XhoI購自Promega，T4 DNA連接酶、T4DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶及dNTPs均購自華美生物公司，DNA合成試劑盒、DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自上海生物工程公司。其他試劑為國產分析純及西安交通大學醫學院遺傳學實驗室自備。

1.2方法

1.2.1鼠GDNFcDNA的擴增

參照GeneBank和文獻報道，設計上下游引物，上游：5'-AGGATCCATGAAGTTATGGGATGTCGT-3'，下游：5'-ACTCGAGTCAGATACATCCACACCGTT-3'。由上海生物工程公司代替合成。按PCR試劑盒說明書將無RNA酶水、dNTPs，5×buffer、已合成的上下游引物、25mmolMgSO4加入到置于冰上的0.2ml離心管中反應條件，混勻后加入T4 DNA連接酶、T4DNA聚合酶。震蕩10秒混勻，放入PCR儀擴增目的基因。反應條件和反應體系如下：

樣品于94℃變性5min，加入2U的Taq聚合酶，按下列參數循環30次：94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，最后一個循環72℃，延伸5min。

結束后擴增樣品在0.8%瓊脂糖凝膠電泳中檢測擴增產物，用DNA marker判斷擴增片段的大小。同時切出GDNFcDNA條帶，用膠回收試劑盒予以回收純化。

1.2.2構建重組質粒pEGFP-GDNFcDNA

將回收的GDNFcDNA和載體質粒用BamHI和XhoI進行雙酶切反應，雙酶切產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢切出DNA條帶用膠回收試劑盒純化后合并，加入T4 DNA連接酶16℃連接過夜

1.2.3轉化感受態細菌、細菌的擴增及質粒提取

取上述連接后反應液10ul，加感受態細菌JM109 100ul冰上放置20min，然后420C熱休克2min， 加1ml LB，37 0C震蕩培養30min， 取100ul涂布到卡那霉素培養平皿上，370C培養過夜。然后挑起單個克隆接種到5ml LB+Kana培養液中37 0C震蕩培養18小時提取質粒.質粒提取方法按質粒提取試劑盒操作手冊中常規堿裂解法提取。質粒命名為pEGFP-GDNG（代號為C3M-GDNF）。

1.2.4質粒的鑒定及pEGFP-GDNF的測序。

將構建的重組質粒pEGFP-GDNF予以雙酶切（BamHI / XhoI）后電泳鑒定及測序。

2 結果

2.1 GDNFcDNA PCR產物的擴增結果

用大鼠的GDNFcDNA中加入設計的引物進行擴增，對擴增產物進行瓊脂糖電泳實驗，純化后獲得的GDNF片段長度630bp，與預期片段長度相一致，無明顯非特異性擴增帶（圖-1）。

2.2 重組質粒pEGFP-GDNFcDNA的雙酶切鑒定結果

將pEGFP-GDNFcDNA用BamHI / XhoI雙酶切，切出GDNAcDNA及pEGFP-C3進行電泳（圖-2），pEGFP-GDNFcDNA經雙酶切后分別切出GDNFcDNA及載體質粒，很據酶切電泳圖譜，重組質粒pEGFP-GDNFcDNA總大小約6.0kb，及雙酶切后切出630bp與5.4kb兩條電泳帶，與預期結果一致。

2.3 pEGFP-GDNFcDNA測序結果

將最終構建成功的pEGFP-GDNFcDNA送交測序，結果如圖（圖-3），與GeneBanK結果一致，測序正確。

3 討論

神經營養因子（NTFs）在神經再生、突觸形成以及神經損傷修復過程中起著重要作用，NTFs由神經元及神經元支配的靶器官或膠質細胞產生，可以在神經軸突中進行順行、逆行性轉運[4] Curtis R，Scherer SS，Somogyi R，Ip NY.Retrograde axonal transport of LIF is increased by peripheral nerve injury：correlation with increased LlF expression in distal nerve.[J].Neuron，1994，12（）：19l-204.，到達神經中樞，發揮其生物學效應。其中GDNF在促進神經元的生長、分化和損傷后的修復方面被認為是最有效的神經營養因子[5] Barbara F，Macie JF，Jurgen E，et al.CNS glial are targets for GDNF and neurturin.[J].Histochem Cell Biol，1998，110（2）：595-601.，不僅對中樞神經系統，而且對周圍的運動、感覺和自主神經系統也有同樣的作用[[[6] Choir DL，Lin Q，Chang YN，et al.Dopaminergic neurons protected from degeneration by glial cell linedderived neurotrophic factor gene therapy[J].Science，1997，275（5）：838-841.，同時在防止神經元的損傷，損傷后的修復再生等方面有其他生長因子無法比擬的作用[7] Hisashi K，Chihoko S，Wen RZ，et al.Induction of glialcell line-derived neurotrophic factor receptor proteins incerebral cortex and striatum after permanent middle cerebral artery occlusion in rat.[J].Brain Research，1999，834（5）：190-195]]。由于GDNF在腦內含量較少，單純依賴生物提取無法大量獲得。而且目前在研究GDNF生物學效應的實驗中，給藥方式絕大多數都是脊髓鞘內或者蛛網膜下腔局部注射治療。局部注射GDNF有很多缺點：首先注射部位定位困難，一次給藥后很快降解，多次給藥使治療復雜，增大了創傷和感染的機會，而且過量的GDNF注射會帶來副作用[8] Georgievska B，Kirik D，Bjorklund A，et al. Aberrant sprouting and downregulation of tyrosine hydroxylase in lesioned nigrostriatal dopamine neurons induced by long-lasting overexpression of glial cell line derived neurotrophic factor in the striatum by lentiviral gene transfer.[J].Exp Neurol，2002，177（2）：461-474]，最后由于GDNF是大分子物質，難以通過血腦屏障，使得其很難到達腦內發揮其生物學作用。因此，學者們將目光集中到基因治療上，及通過一定的載體將GDNA轉入體內，使其在體內穩定表達，長期發揮其生物學效應。

基因治療的步驟包括：目的基因的獲得，表達載體的構建，靶細胞的選擇，將目的基因導入靶細胞的方法，目的基因在宿主細胞的表達。本研究根據GeneBank報道的GDNF基因序列，自行設計引物，使GDNFcDNA大量擴增，瓊脂糖電泳結果表明，擴增的DNA長630bp，與文獻報道一致。接著對擴增產物及脂質體進行酶切，構建重組質粒pEGFP-GDNF cDNA。根據文獻報道，GDNF的N末端氨基酸殘基對其生物活性的維持作用不大[9]Eigenbrot C，Gerber N. X-ray structure of glial cell-derived neurotrophic 1.9 resolution and implications for receptor binding[J].Nat Struct Biol，1997，4：435-438.]]，因此目前絕大多數實驗是將EGFP基因連接到GDNF基因的5‘端，兩者之間以編碼柔軟肽段的核苷酸連接以保持EGFP與GDNF各自的活性，這樣既保留了GDNF蛋白對神經的營養活性，又可以通過EGFP觀察GDNF蛋白在體內的表達[10] Che ZY，He ZY，He C，et al.Human glial cell-derived neurotrophic factor：a [11]structure-function analysis[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，268（3）：692-696..。本實驗同樣將質粒連接到GDNF基因的5‘端，為下一步觀察將重組質粒轉染到靶細胞后的生物學效應提供了依據。但通過該方法構建的重組質粒在動物體內是否可以發揮正常生物學活性，還需動物實驗證實。目的基因與載體形成重組體的過程中需要特異性核酸內切酶，限制性內切酶酶切后產生的是兩種不相同的粘性末端，提高了基因重組技術中T4 DNA連接酶連接反應的效率。及確保GDNFcDNA片段是正向、單倍插入到載體pEGFP-C3中。對重組質粒再次用限制性內切酶BamHI 、XhoI雙酶切進行雙酶切，根據電泳條帶重組質粒大小6.0Kb，切出的擴增產物大小約630bp，pEGFP-C3大小為5400bp，兩者之和為重組質粒的大小，證明通過雙酶切連接后確實得到了需要的重組質粒。抽提質粒DNA成功的關鍵是把染色體DNA、蛋白質、RNA去除干凈，獲得純度較高的質粒DNA。由圖-2第3道電泳圖譜可以看出有兩條電泳亮帶，其中分子量小的大約相當于3.5kb的條帶可能就是未除去的蛋白質或RNA，也有可能是質粒酶切不完全導致連接產物中含有空質粒。針對這一問題，我們加強了對電泳膠帶的回收純化，并應用YT豐富的培養基，用多級培養的方法，在大腸桿菌的培養基內挑取一個單一菌落在接種到一個新的培養基，經培養一段時間后再次挑取單一菌落接種只新的培養基，如此反復多次，則可保證提取質粒DNA的參量和純度，另外在抽提過程中要把握好變性和復性的時機，使試劑與染色體充分作用變性，又要使染色體DNA不至斷裂與質粒DNA相混淆。

大腸桿菌表達系統是較為常用的一種。其優點是遺傳背景比較清楚，表達水平較穩定，易操作，有許多菌株突變體和含強啟動子的載體可供選擇，并且成本低、蛋白表達量高、容易純化等。在重組質粒的構建中，本實驗是通過化學法將GDNF和質粒連接反應液轉化JM109感受態，感受態是本實驗室通過CaCl2法制備獲得，將PCR陽性單菌落挑至新鮮的LB液體培養基中過夜培養，第二天將菌液送西安交通大學法醫學司法鑒定中心代為測序，結果表明片段為630bp，與文獻報道一致，且未發生突變。

本研究成功擴增大鼠GDNFcDNA基因，并成功構建重組質粒pEGFP-GDNFcDNA，經雙酶切及測序證明與文獻報道一致，未發生異常突變。GDNF因其具有強大的神經營養作用，而被越來越多的應用到帕金森、腦缺血、脊髓損傷、神經痛等的治療和神經再生研究中，本課題成功擴增并構建重組質粒，對于GDNF的基因治療及下一步利用合適的載體介導重組質粒在大鼠體內轉染，觀察GDNF基因治療的可行性并進一步驗證該重組質粒的活性奠定了基礎。

參考文獻

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[8]Georgievska B，Kirik D，Bjorklund A，et al. Aberrant sprouting and downregulation of tyrosine hydroxylase in lesioned nigrostriatal dopamine neurons induced by long-lasting overexpression of glial cell line derived neurotrophic factor in the striatum by lentiviral gene transfer.[J].Exp Neurol，2002，177（2）：461-474

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